拟南芥AtDsbA活性研究及底物蛋白的捕获

摘要

蛋白质二硫键是维持空间结构的重要共价键，二硫键的形成是蛋白质折叠和成熟的重要步骤，某些蛋白质的活性还可以通过二硫键氧化态和还原态之间可逆转化，实现蛋白质活性调节。最近在拟南芥类囊体膜上发现了一种新的氧化还原酶，包含2个功能结构域，其中，膜结构域是哺乳动物维生素K环氧化物还原酶同源类似物，而水溶性结构域属于硫氧还蛋白家族，与大肠杆菌参与二硫键形成的周质蛋白DsbA在二级结构上有相似性，我们称之为AtDsbA。为了研究AtDsbA在叶绿体内的作用机制及其在叶绿体内的具体功能，本文构建了AtDsbA的表达载体，进行了原核表达和纯化，在此基础上研究了AtDsbA催化蛋白质二硫键转化的作用、与催化作用有关的氨基酸位点并通过亲和层析捕获了AtDsbA在叶绿体中的可能作用底物。具体结果如下：
　　 (1)AtDsbA的氧化活性分析。变性的RNaseA在体外可以自主复性折叠，还原态半胱氨酸巯基可以自发氧化成二硫键，而在RNaseA复性过程中加入AtDsbA可以显著促进RNaseA的氧化折叠过程，动力学分析表明，AtDsbA促氧化折叠活性是浓度依赖性的，说明AtDsbA具有二硫键氧化酶活性。
　　 (2)AtDsbA的还原活性分析。包含一对二硫键的天然胰岛素可以被低浓度的二硫苏糖醇(DTT)还原，但速度较慢，而加入DTT的同时加入AtDsbA，胰岛素被还原的速度会大大加快，随着AtDsbA浓度的增加，胰岛素被还原的速度也增加，说明AtDsbA也具有二硫键还原酶活性。
　　 (3)AtDsbA的异构酶活性分析。为了检测AtDsbA是否具有异构酶活性，首先将变性的RNaseA用强氧化剂铁氰化钾处理，虽有大量二硫键产生，但RNaseA活性低，说明大量的二硫键为错配二硫键。将含有大量错配二硫键的RNaseA在氧化态与还原态一定比例的谷胱甘肽缓冲液中复性时，AtDsbA存在下，RNaseA的活性恢复增快，说明AtDsbA可以打开错配的二硫键并帮助形成正确配对的二硫键，即AtDsbA具有二硫键异构酶活性。
　　 (4)AtDsbA蛋白序列中2个相邻半胱氨酸(CXXC)是活性必需氨基酸。氧化还原酶类催化电子转移时往往通过酶分子中巯基与二硫键相互转化来实现，AtDsbA有4个半胱氨酸，其中2个半胱氨酸之间相隔2个氨基酸，称为相邻半胱氨酸，另外2个相间15个氨基酸，那么哪些半胱氨酸直接参与氧化还原反应呢?我们对编码基因进行了定位突变，经原核表达和蛋白纯化后，测定AtDsbA活性变化，结果两个显示相邻半胱氨酸(CXXC)突变后AtDsbA丧失氧化还原酶及异构酶活性，而另外2个分开的半胱氨酸突变后，AtDsbA没有变化。
　　 (5)AtDsbA底物蛋白的捕获。在体内AtDsbA结构域与VKOR结构域融合在一起存在于植物叶绿体中，为了检测AtDsbA可能作用于叶绿体内哪些哪些底物蛋白进而参与代谢，本实验将AtDsbA活性部位CXXC中C端半胱氨酸突变为丙氨酸，原核表达并纯化突变体蛋白后，与叶绿体总蛋白作用，通过亲和层析的方法捕获与AtDsbA直接结合的蛋白质，电泳分离得到2个与AtDsbA结合的复合物，经PMF质谱鉴定为At4g31390和基因At2g26720编码的蛋白产物。其中，At4g31390编码蛋白为一种与醌的合成有关的蛋白激酶，而At2g26720编码蛋白主要与蛋白质的泛素化降解有关。
　　 (6)由AtDsbA的氧化还原活性及异构酶活性可知，AtDsbA在叶绿体类囊体内可以通过促进其蛋白质的氧化折叠发挥作用。通过捕获的AtDsbA的互作蛋白可知，AtDsbA可以通过调节基因At4g31390和基因At2g26720编码的蛋白产物而参与代谢。