FABP4基因启动子活性分析及同型半胱氨酸对其启动活性的调控作用

摘要

目的：研究同型半胱氨酸对人源FABP4启动子活性的影响及DNA甲基化调控的具体机制，以探索同型半胱氨酸致动脉粥样硬化可能的治疗靶点。
　　方法：本课题分别以HEK-293A细胞及人源诱导巨噬细胞为研究对象。应用生物信息学方法获得并预测FABP4基因启动子区顺式转录作用元件和反式作用因子的结果，以pGL3-basic为工具载体采用基因重组法构建启动子截取片段，转染HEK-293A细胞观察不同截取片段的荧光素酶活性变化并分析不同截取片段的转录启动活性功能。观察不同浓度0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L的同型半胱氨酸及100μmol/L同型半胱氨酸+叶酸、VitB12和5-氮杂胞苷（AZC）干预腺病毒转染转录活性最强的FABP4基因启动子截取片段中巨噬细胞荧光素酶活性变化。巢式降落式甲基化特异性PCR(ntMS-PCR)检测FABP4启动子甲基化水平。
　　结果：构建好插入pGL3-basic重组载体的截取片段转染HEK-293A细胞后测得荧光素酶活性显示，与空载体pGL3对照组相比较，-1000/-1片段组启动活性没有明显改变；-500/-1片段组和-2000/-1片段组启动活性明显增加，它们转录活性分别约为空载体pGL3对照组的2.5倍（p<0.01）和3倍（p<0.01），而-2000/-1501片段组是空载体pGL3对照组的1.5倍（p<0.01），-2000/-1片段组转录活性最强；-2000/-1片段组转录活性约为-500/-1片段组片段组的1.2倍（p<0.01）。对照载体pRL-TK所携带的启动子是HSV1-TK基因自身启动子,FABP4基因启动子的启动活性均在TK启动活性的40％以下。
　　不同浓度Hcy作用FABP4基因启动子（-2000/-1）后，与0μmol/L Hcy浓度组比较，50μmol/L Hcy浓度组启动活性略有降低，500μmol/L Hcy浓度组启动活性明显降低，均无显著性差异；100μmol/L Hcy浓度组和200μmol/L Hcy浓度组启动活性明显升高，100μmol/L Hcy浓度组约为0μmol/L Hcy浓度组和500μmol/L Hcy浓度组的3倍（p<0.01），约为50μmol/L Hcy浓度组的4倍（p<0.01）；与0μmol/L Hcy浓度组比较，用甲基化转移酶抑制剂AZC作用后，FABP4基因启动活性增高3倍，差异有显著性（p<0.01）；与100μmol/L Hcy浓度组比较，给予叶酸和VitB12干预后，启动子启动活性大约降低10%，差异有显著性（p<0.01）。
　　DNA甲基化状态的改变可以影响基因的转录。FABP4基因DNA甲基化状态检测结果发现，与对照组比较，100μmol/L Hcy组甲基化水平下降了大约45.4%，具有显著性差异(P<0.05)；叶酸和VitB12干预后甲基化水平较100μmol/L Hcy上升55.5%，具有显著性差异(P<0.05)；AZC组较0μmol/L Hcy组甲基化程度低约1.5倍，具有显著性差异(P<0.05)。mRNA的表达是基因转录的第一步，FABP4的mRNA的表达状态检测结果发现，与对照组比较，100μmol/L Hcy组mRNA的表达水平上升了大约5倍，具有显著性差异(P<0.01)；叶酸和VitB12干预后mRNA的表达水平较100μmol/L Hcy下降9倍，具有显著性差异(P<0.01)；AZC组较对照组mRNA的表达高6倍，具有显著性差异(P<0.01)。蛋白的产生是基因表达关键的最终阶段也是产生具有活性蛋白质的第一阶段，FABP4蛋白表达检测结果发现，与对照组比较，100μmol/L Hcy组蛋白产生水平上升了大约2倍，具有显著性差异(P<0.05)；叶酸和VitB12干预后蛋白产生水平较100μmol/L Hcy下降约20%，具有显著性差异(P<0.05)；AZC组较对照组组蛋白表达增加约15%，具有显著性差异(P<0.05)。
　　结论：FABP4基因启动子属于弱启动子；FABP4基因核心启动子是由CAAT盒组成的，转录起始点位于转录起始上游的第67个碱基；CpG岛参与了基因的调控；转录抑制因子也参与了调控FABP4基因转录；FABP4基因启动子可能存在沉默子；同型半胱氨酸可以通过调节FABP4基因启动子甲基化影响转录；100μmol/L与200μmol/L同型半胱氨酸浓度与FABP4基因转录呈现一定关系，使其发生低甲基化；补充一定量的叶酸和VitB12对同型半胱氨酸引起的FABP4增高有一定治疗作用。

目录

声明

符号说明

前言

参考文献

第一部分FABP4基因启动子调控元件的初步鉴定

引言

材料和方法

结果

结论

参考文献

第二部分同型半胱氨酸对FABP4启动子活性的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分Hcy对巨噬细胞FABP4启动子甲基化作用的验证

引言

材料与方法

结果

结论

参考文献

全文总结

综述:免疫炎症反应在动脉粥样硬化中的作用

致谢

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