青岛地区规模化兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性调查研究

摘要

兔的梭菌性肠炎是由产气荚膜梭菌感染引起的严重危害养兔业的一种疾病，近年来青岛地区养兔业发展较快，规模化养殖迅猛发展，而随着兔场规模化发展和国内外对抗生素促生长剂使用越来越严格的限制，兔产气荚膜梭菌病有愈演愈烈的趋势。为了更好地控制此病，本研究调查了青岛地区规模化兔场爆发此病时产气荚膜梭菌的毒素型及遗传多样性。采集青岛地区规模化养兔场疑似产气荚膜梭菌感染兔的肝脏进行产气荚膜梭菌的分离鉴定，采用Multiple-PCR方法对分离菌株进行毒素型分析，应用ERIC-PCR方法分析分离菌株的遗传多样性。共分离到25株产气荚膜梭菌，其中A型24株(96％)，C型1株(4％)。用ERIC-PCR方法将25株分离株分于9个聚类中，其中V型为主要流行型。结果表明:青岛地区规模化兔场中产气荚膜梭菌流行的毒素型主要为A型，且具有多种基因亚型，其中V型为主要流行型。此结果为该地区兔产气荚膜梭菌病的免疫和微生态防治提供了重要的参考依据。
　　 在此基础上，为进一步了解青岛地区产气荚膜梭菌流行株近几年出现的毒素型、遗传多样性和耐药性变化，本研究选取06、12年从青岛规模化兔场分离的产气荚膜梭菌菌株各15株，分别用Multiple-PCR、ERIC-PCR和药敏纸片法对分离菌株的毒素型、遗传多样性和耐药性进行检测。结果表明:06年分离的产气荚膜梭菌流行株均为A型，β2毒素、肠毒素和NetB毒素的检出率分别为11.3％、0、0;12年分离的产气荚膜梭菌流行株15株中A型14株、C型1株，β2、肠毒素和NetB毒素的检出率分别为40％、0、0。30株产气荚膜梭菌流行株通过ERIC-PCR方法分为14个亚型，其中06年分离株分布于8个亚型，V型为主要流行型;12年分离株也分布于其中8个亚型中，主要流行型为Ⅲ型和Ⅺ型。产气荚膜梭菌12年流行株比06年产气荚膜梭菌流行株对先锋霉素、强力霉素、万古霉素、青霉素的耐药率大幅度提高。结果显示:自2006年以来，青岛规模化兔场产气荚膜梭菌流行株在毒素基因携带情况、遗传多样性和耐药性上均发生了较大变化，这一结果为今后该地区兔场产气荚膜梭菌病的防控提供依据据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 产气荚膜梭菌简介

1．2 产气荚膜梭菌的主要毒力因子

1．3 兔产气荚膜梭菌病的临床发病特征

1．3．1 流行特点

1．3．2 临床症状和病理变化

1．4 兔产气荚膜梭菌病的诊断和防治

1．4．1 传统细菌学诊断

1．4．2 分子生物学诊断

1．4．3 防治措施

1．5 ERIC-PCR技术

1．5．1 ERIC结构特征及功能

1．5．2 ERIC-PCR产物形成规律

1．5．3 ERIC-PCR的建立

1．5．4 ERIC-PCR在微生物分类鉴定中的应用

1．6 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 兔场情况

2．1．2 参考菌株

2．1．3 培养基和试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 引物设计

2．2 兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性调查

2．2．1 样品分离鉴定

2．2．2 菌株的分离鉴定与参考菌株的复活

2．2．3 DNA的提取和浓度测定

2．2．4 多重PCR鉴定菌株的毒素型

2．2．5 ERIC-PCR分析

2．2．6 药敏试验

2．3 兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性变化分析

2．3．1 菌株复活

2．3．2 DNA的提取和浓度测定

2．3．3 多重PCR鉴定菌株的毒素型

2．3．4 ERIC-PCR分型

2．3．5 药敏试验

3 结果与分析

3．1 兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性调查结果

3．1．1 样品初步分离鉴定结果

3．1．2 DNA提取和浓度测定结果

3．1．3 产气荚膜梭菌分离株多重PCR鉴定结果

3．1．4 ERIC-PCR分析结果

3．1．5 药敏试验结果

3．2 兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性变化分析结果

3．2．1 菌种复活结果

3．2．2 DNA提取和浓度测定结果

3．2．3 产气荚膜梭菌分离株多重PCR鉴定结果

3．2．4 ERIC-PCR结果

3．2．5 药敏试验结果

4．讨论

4．1 兔产气荚膜梭菌病对规模化兔场的危害

4．2 肝脏分离产气荚膜梭菌的意义

4．3 二步多重PCR体系的建立

4．4 NetB毒素基因的检测

4．5 ERIC-PCR方法检测产气荚膜梭菌的遗传多样性

4．6 不同年份产气荚膜梭菌分离株毒素型、遗传多样性和耐药性变化

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文