济南地区鸭源新城疫病毒的分离鉴定及F基因变异分析

摘要

鸭新城疫是由新城疫病毒引起的一类急性、高度接触性和致死性的传染病。该病以腹泻和神经症状，腺胃黏膜局灶性出血或溃疡，肠道黏膜枣核样出血及胰腺或脾脏有白色坏死点为主要特征。新城疫病毒对水禽的致病力在逐渐增强，水禽不仅是新城疫的宿主和储存库，而且成为新城疫病毒的易感禽类。新城疫病毒长期以来一直是危害我国养禽业的主要病原之一。新城疫病毒主要引起鸡的新城疫、鹅源新城疫、鸽源新城疫等，但近年来新城疫病毒感染并致病的宿主范围有扩大的趋势。且有报道显示，不同禽源的新城疫病毒分离株的毒力及其相关毒力基因、免疫原活性和致病性等生物学特性并非完全一致。所以进行对新城疫各种不同禽源分离毒株的主要生物学特性的研究，有利于探索该病毒在不同禽类之间感染与传播的机制、病毒的进化机制及其疾病的流行病学调查等方面的研究。
　　 近年来，鸭新城疫的感染呈上升趋势，将对我国的养鸭业产生巨大危害。加强对鸭新城疫病毒的研究，对预防和控制鸭新城疫的流行，保护和促进我国养鸭业的健康发展具有重要意义。
　　 本研究是从济南地区鸭病料中分离得到三株鸭新城疫病毒。通过RT-PCR技术对这三株鸭新城疫病毒的F基因进行扩增，并进行序列测定，分析测序结果。并与GeneBank上已发表的新城疫病毒序列和传统疫苗株基因进行核酸同源性比较、遗传进化树分析，从而在分子生物学水平上分析济南地区鸭源新城疫病毒分离株之间的亲缘关系以及与其它地区流行毒株之间的亲缘关系，为该病的防控提供理论依据。
　　 在济南地区从临床疑似新城疫症状的鸭中解剖收集病料，鸡胚盲传三代分离得到三株病毒，按常规方法进行血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)，结果显示该三株病毒均具有血凝特性，且血凝特性能被NDV阳性血清所抑制，而不被H9亚型和H5亚型AIV阳性血清所抑制，通过RT-PCR技术扩增出特异性目的条带，因此鉴定为鸭源新城疫病毒，并依次命名为SDJN01、SDJN02、SDJN03株。通过试验测得鸭胚半数致死量ELD50为10-7.8-10-8.2，ICPI为1.68-1.74，MDT为50.6h-54.6h。综合以上生物学毒力指标，表明3株分离毒株均为新城疫强毒株。
　　 采用RT-PCR对3株分离毒株的F基因进行扩增和序列测定分析，结果表明，3株分离毒株间同源性在98.5％-100％，氨基酸同源性在98.7％-100％之间，与GeneBank上已发表的与其他鸭源、鹅源NDV同源性为96.0％～98.5％;但与LaSota株的核苷酸同源性为83.9％-84.8％，氨基酸同源性为88.6％-89.2％;遗传进化分析表明，3株鸭新城疫病毒与黑龙江、江苏、福建等地的鹅新城疫病毒毒株和鸭新城疫病毒毒株的亲缘性较近。分离的3株病毒与目前国内分离的鸭源、鹅源新城疫病毒的F基因亲缘性均较高，与LaSota株的F基因相比变异较大。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 鸭新城疫病毒的概述

1．1．1 病毒的分类、大小与形态特征

1．1．2 理化特性

1．1．3 培养特性

1．1．4 流行病学

1．1．5 临床症状及病理变化

1．1．6 病毒的致病机理

1．1．7 实验室诊断

1．2 NDV的基因组与F蛋白的结构和功能

1．2．1 NDV的基因组

1．2．2 F蛋白的结构和功能

1．3 NDV的毒力与致病性

1．4 鸭NDV的防制

1．4．1 鸭新城疫的预防

1．4．2 鸭新城疫的治疗

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病料与试验动物

2．1．2 主要仪器与试剂

2．1．3 引物设计

2．2 方法

2．2．1 病毒的分离传代

2．2．2 血凝性试验(HA)和血凝抑制(HI)试验

2．2．3 鸡胚半数感染量(EID50)的测定

2．2．4 鸡胚平均致死时间(MDT)的测定

2．2．5 1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)的测定

2．2．6 动物致病性试验

2．2．7 RT-PCR扩增F基因及序列分析

3 结果与分析

3．1 病毒的分离与鉴定

3．2 ELD50、MDT及ICPI的测定结果

3．3 致病性试验

3．4 F基因RT-PCR扩增

3．5 重组质粒的酶切鉴定结果

3．6 测序结果及序列分析

4 讨论

5 结论

6．创新点

参考文献

致谢

攻读专业学位期间发表的文章