H9N2亚型禽流感病毒HA基因真核和原核表达及其单因子血清的制备

摘要

近年来，禽流感的暴发与流行给养禽业的发展和公共卫生安全造成了严重的危害。2003年12月9日，香港发生H9N2亚型禽流感疫情，H9N2亚型为低致病性禽流感病毒，但是因为它传播广泛，而且同样可引起人和动物致病，甚至引起疫病的暴发和流行，其危害不容忽视，做好禽流感的诊断与监测显得尤为重要。更为重要的是禽流感病毒亚型众多且变异性强，给检测带来了很大困难。
　　 禽流感病毒蛋白质含有5种多肽，即血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白、核蛋白和多聚酶。血凝素是流感病毒的主要表面糖蛋白，具有凝集多种动物红细胞的性质，借助HA对细胞受体的作用，使病毒粘附于细胞，在穿膜过程中起关键作用。HA的变异性很强，是病毒发生抗原变异的主要原因。HA具有诱生中和抗体的能力，产生免疫保护作用，因此血凝素在禽流感的诊断和防治中起重要作用，成为禽流感的研究热点。
　　 本课题起初是以禽流感HA基因为靶点构建真核表达质粒。我们首先通过RT-PCR方法扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA基因并克隆插入到真核质粒pcDNA3.1-A中，构建了真核表达质粒pcDNA3.1-A-HA。将构建的真核表达质粒通过脂质体转染CEF，鉴定其在CEF上的表达。同时通过设计不同引物构建了三种PET-32a(+)/HA原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中通过IPTG诱导表达，然后用HA蛋白和真核表达质粒pcDNA3.1-A-HA联合以及HA蛋白单独免疫小鼠，制备了抗HA蛋白的单因子血清，并通过间接免疫荧光方法检测了此单因子血清的特异性。比较两种不同方法得到的抗HA蛋白的单因子血清，结果显示，这两种抗体都具有具有很好的免疫反应性，并且单因子血清IFA效价接近。本研究为进一步研发禽流感病毒疫苗及诊断试剂提供了重要的实验材料及有价值的数据。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 禽流感概述

1．1．1 禽流感的流行病学特点

1．1．2 禽流感的主要症状和病变

1．1．3 诊断

1．1．4 鉴别诊断

1．1．5 治疗

1．1．6 预防

1．2 禽流感病毒

1．2．1 禽流感病毒的发现

1．2．2 禽流感病毒的分类与命名

1．2．3 流感病毒基因组结构及其编码蛋白

1．2．4 流感病毒的复制

1．2．5 禽流感病毒抗原性的改变

1．2．6 流感病毒的理化特性

1．3 HA基因特点

1．3．1 HA基因序列

1．3．2 HA编码的蛋白质

1．3．3 HA蛋白的生物学功能

1．4 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病毒株

2．1．2 菌株和质粒载体

2．1．3 细菌培养基的试剂

2．1．4 动物和细胞

2．1．5 细胞培养材料

2．1．6 转染试剂

2．1．7 其它试剂

2．2 实验方法

2．2．1 主要溶液的配制

2．2．2 禽流感HA基因的钓取

2．2．3 重组真核表达质粒的构建

2．2．4 重组真核表达质粒在CEF上的表达

2．2．5 HA基因上、中、下段克隆载体的构建

2．2．6 HA基因上、中、下段原核表达载体的构建

2．2．7 重组菌的诱导表达

2．2．8 western blot

2．2．9 重组蛋白的可溶性分析

2．2．10 重组原核表达载体HA蛋白的大量表达及定量

2．2．11 AIV-HA单因子血清的获得

3 结果

3．1 AIV-HA基因的真核表达质粒

3．1．1 AIVLG1株HA基因的PCR扩增

3．1．2 克隆载体的PCR鉴定

3．1．3 序列测定与分析

3．1．4 真核表达质粒的PCR鉴定

3．1．5 真核表达质粒的酶切鉴定

3．2 AIV-HA基因的原核表达载体的构建

3．2．1 AIVLG1株HA(上、中、下)基因的PCR扩增

3．2．2 克隆载体的PCR鉴定

3．2．3 序列测定与分析

3．2．4 原核表达载体的PCR鉴定

3．2．5 序列鉴定

3．3 真核表达质粒pcDNA3．1-A-HA在CEF上的表达

3．4 重组质粒pET-32a(+)-HA阳性转化菌裂解物的SDS-PAGE

3．5 western blot检测

3．6 两种单因子血清间接免疫荧光反应效价比较

4 讨论

4．1 HA基因的提取

4．2 HA基因真核表达质粒的构建

4．3 HA基因真核表达质粒在CEF上的表达

4．4 HA蛋白的原核表达

4．5 小鼠免疫

4．6 两种HA单因子血清的IFA特异性比较

4．7 两种HA单因子血清的应用

5 结论

参考文献

个人简介

致谢

硕士期间发表的论文