新型犬流感病毒H5N2亚型病原学调查及其HA,NP,NA基因序列分析

摘要

2009年本实验室展光建等人从犬中分离到一株新型H5N2亚型流感病毒，随后宋倩倩等人又通过致病性实验证明该亚型的病毒在犬间进行水平传播，这也进一步警示人们该亚型流感病毒可能会成为潜在的流行毒株。为揭示该亚型病毒在自然犬的流行情况以及其在自然状态下的变异情况，本研究对该亚型流感病毒进行了病原学调查，并采用分子生物学技术对其HA、NA、NP基因进行了序列分析。
　　 本研究共采集了96份疑似流感病毒感染的病犬的鼻拭子样品，对样品进行常规处理，接种9-11日龄的鸡胚，进行病毒分离鉴定，成功分离到三株病毒，经血凝试验/血凝抑制试验、RT-PCR以及基因序列分析，这三株病毒均为H5N2亚型流感病毒，分别将这3株H5N2亚型流感病毒命名为A/Canine/Shan Dong/01/2012(H5N2)、A/Canine/Shan Dong/02/2012(H5N2)、A/Canine/Shan Dong/03/2012(H5N2)，以上病毒简称为CA/SD/01/12(H5N2)、CA/SD/02/12(H5N2)、CA/SD/03/12(H5N2)。
　　 三株病毒的HA蛋白上有许多受体结合位点，这些结合位点上的氨基酸序列均很保守，在HA蛋白受体结合位点方面分离株CA/SD/01/12(H5N2)、CA/SD/02/12(H5N2)、CA/SD/03/12(H5N2)与其他参考株相似，均没有发生较大的突变。在核苷酸同源性方面，CA/SD/01/12(H5N2)，CA/SD/02/12(H5N2)，CA/SD/03/12(H5N2)彼此都达到90.0％以上。三株分离株均与A/Dog/Shandong/JT01/2009同源性最高，分别可达到99.4％、99.3％、99.6％。在蛋白位点方面三株分离株与参考株A/Dog/Shandong/JT01/2009相比均只发生一处突变，三株病毒蛋白裂解位点均为PQ↓ REIRRK，从分子水平推论均属于非高致病性毒株。CA/SD/01/12(H5N2)所测HA蛋白有3个糖基化位点，分别为-NQTD-，-NSSM-，-NGTY-，分别在169、310、478位;CA/SD/02/12(H5N2)所测HA蛋白有4个糖基化位点-NQTD-，-NSSM-，-NGTY-，-NSSY-分别位于169、310、460、478位;CA/SD/03/12(H5N2)所测HA蛋白有3个糖基化位点-NQTD-，-NSSM-，-NSSY-分别位于169、310、460位;糖链的改变对毒株的毒力也有十分重要的影响，糖基化位点处发生改变很容易导致HA对蛋白酶的敏感性增强，可以使毒株变为高致病性。
　　 三株病毒的NA基因全长1309bp，可编码401个氨基酸，该基因在核苷酸同源性方面，CA/SD/01/12(H5N2)，CA/SD/02/12(H5N2)，CA/SD/03/12(H5N2)都达到90.0％以上，且该三株分离株均与A/Dog/Shandong/JT01/2009核苷酸同源性较高分别可达到98.1％、98.3％、98.4％，从而证明我们所分离到的三株H5N2病毒的NA基因与参考株A/Dog/Shandong/JT01/2009具有最近的亲缘关系。在NA基因的颈部有几个重要的氨基酸残基分别位于118位、119位、151位、152位;同时在NA基因的头部有7个重要的抗体表位，在分离株中这些重要的氨基酸残基以及抗体位点均未发现变异。但是在该基因的其他部位与参考毒株A/Dog/Shandong/JT01/2009相比CA/SD/01/12(H5N2) CA/SD/01/12(H5N2) CA/SD/01/12(H5N2)发现了多处突变。三株分离株彼此之间也存在突变，CA/SD/01/12(H5N2)与CA/SD/02/12(H5N2)位于第36位、CA/SD/01/12(H5N2)与CA/SD/03/12(H5N2)位于第233位、CA/SD/02/12(H5N2)与CA/SD/03/12(H5N2)突变位于第36位和第233位。据此我们推测病毒的复制能力可能会受到一些影响同时也可能影响到分离株病毒的宿主范围。
　　 NP基因经PCR扩增后全长1592bp，编码508个氨基酸，核苷酸同源性方面，CA/SD/01/12(H5N2)，CA/SD/02/12(H5N2)，CA/SD/03/12(H5N2)都达到90.0％以上。三株分离株在核苷酸同源性方面与A/Dog/Shandong/JT01/2009以及A/Swine/Fujian/F1/2001(H5N1)均很高且均可达到99.5％以上，但该蛋白在氨基酸同源性方面却与A/Swine/Fujian/F1/2001(H5N1)较为接近，其同源性分别可达到99.1％、99.5％、99.3％。在蛋白位点方面三株分离株与参考株A/Dog/Shandong/JT01/2009相比CA/SD/01/12(H5N2) CA/SD/01/12(H5N2) CA/SD/01/12(H5N2)发现了多处突变。;CA/SD/01/12(H5N2)与CA/SD/02/12(H5N2)相比存在1处突变位于第102位，CA/SD/01/12(H5N2)与CA/SD/03/12(H5N2)相比存在2处突变分别位于第153位和第154位，CA/SD/02/12(H5N2)与CA/SD/03/12(H5N2)相比存在3处突变，分别位于第102位、153位和154位。
　　 该实验是继2009年第一次分离到该亚型流感病毒之后，又成功分离到三株犬H5N2新型流感病毒，进一步证明了新型H5N2亚型犬流感病毒在犬中存在、流行。因犬与畜禽的关系密切，尤其犬作为宠物，饲养量越来越大，这畜禽的健康养殖以及人类的生命健康造成了潜在的威胁，该研究为犬流感病毒H5N2亚型的防控提供了流行病学数据，具有重要的公共卫生学意义。

目录

声明

符号说明

摘要

前言

1．犬流感病毒综述

1．1 流感病毒病原学特征

1．2 流感病毒的分类

1．3 犬流感病毒(CIV)的特性

1．4 流感病毒的复制与变异机制

1．5 犬流感病毒(CIV)的流行病学调查

1．6 流感病毒跨宿主传播机制

1．7 犬流感病毒(CIV)的诊断

1．8 犬流感病毒(CIV)的症状与防治

1．9 犬流感病毒研究的公共卫生学意义

2．材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 病原分离鉴定结果

3．2 分离株HA、NA、NP基因的RT-PCR扩增结果

3．3 重组载体的酶切鉴定结果

3．4 分离株核苷酸序列分析结果

3．5 分离株氨基酸序列分析结果

3．6 分离株的遗传进化树分析结果

4 讨论

5 结论

参考文献

攻读学位期间发表论文情况

致谢

附录