禽流感病毒H9N2亚型贵州株的分离鉴定及HA、NA基因的克隆与序列分析

摘要

[目的]：
　　了解H9N2亚型禽流感在贵州省养鸡场中的感染状况及其病毒HA/NA基因的变异特点及遗传演化特征，为贵州省H9N2亚型禽流感的预防控制提供科学依据。
　　[方法]：
　　(1)采集贵州省不同养鸡场中免疫鸡群和非免疫鸡群血清样本，采用血凝抑制试验检测H9亚型禽流感的血清抗体，以了解贵州省鸡群H9亚型禽流感的疫情动态。
　　(2)采用鸡胚分离培养、血清学试验和RT-PCR方法对发病鸡群组织病料进行H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定，并对分离毒株的一些生物学特性进行测定分析。
　　(3)根据GenBank登载的H9N2亚型AIV参考毒株HA/NA基因设计引物，以提取的分离株RNA为模板进行RT-PCR扩增，然后克隆测序，并运用DNAStar等软件进行生物信息学分析。
　　[结果]：
　　(1)对43个非免疫鸡群1255份鸡血清样本进行检测，结果显示H9N2亚型禽流感抗体的阳性率为18.2％(229/1255)；而在57个免疫鸡群2693份鸡血清样本中，H9N2亚型禽流感免疫抗体的合格率达78.5％(2115/2693)。
　　(2)采集12个养鸡场发病鸡组织病料接种鸡胚后，仅有3号养鸡场组织病料的鸡胚尿囊液具有血凝效价(为24)，经鸡胚传代3代后其血凝效价可达210；将该鸡胚尿囊液分别与H5、H7和H9亚型禽流感抗体以及新城疫抗体进行血凝抑制试验，结果只有H9亚型禽流感抗体呈现抑制反应；应用H9N2亚型禽流感病毒特异性引物进行RT-PCR检测，结果可见到与预期大小相一致(H9亚型的488bp和N2亚型的377bp)的DNA条带。
　　(3)测定结果显示，贵州株对4周龄雏鸡不致死、IVPI为0、ICPI为0.217、56℃水浴15min即可影响其血凝活性且为慢速血凝解脱型，符合AIVH9亚型的生物学特性；接种4周龄雏鸡可呈现与临床发病鸡相似的症状且能回收到该病毒。
　　(4)克隆测序结果表明，分离株HA基因全长为1738bp，可编码561个氨基酸；与国内外参考株相应序列的同源性在82.4％～98.2％之间；推导氨基酸序列的裂解位点为paRSSR↓GLF，属于低致病性H9N2亚型AIV模式；含有5个潜在的糖基化位点，在145、218和551缺失三个潜在的糖基化位点；受体结合位点分别在202位和204位发生亮氨酸(L)→异亮氨酸(I)和谷氨酰氨(Q)→苏氨酸(T)替换；从HA基因系统发育树上显示该毒株为欧亚种系Y280分支。
　　(5)分离株NA基因全长为1414bp，可编码467个氨基酸，与国内外参考毒株相应序列的同源性在87.5％～98.1％之间；含有6个潜在的糖基化位点；在63～65位缺失T、E、I三个茎部氨基酸，也导致了第61位糖基化位点丢失；从NA基因系统发育树看，该毒株也属于欧亚种系Y280分支。
　　[结论]：
　　(1)在贵州省非免疫鸡群中已普遍存在H9亚型禽流感病毒的感染，而通过免疫接种可使鸡群获得较高的H9亚型禽流感免疫抗体水平。
　　(2)成功从临床病料中分离到1株低致病力的H9N2亚型禽流感病毒毒株，并命名为A/Chicken/GuiZhou/01/2008。
　　(3)经对分离株HA/NA基因的克隆测序分析表明，H9N2亚型禽流感病毒贵州分离株属欧亚种系Y280分支。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

缩略词表

文献综述禽流感病毒研究进展

实验研究

1 材料

1.1 血清样品

1.3 病毒和鸡胚

1.4 主要试剂

1.5 常用溶液的配制

1.6 克隆试剂和培养基的配制

1.7 主要仪器设备

2 方法

2.1 贵州省 AIV H9 亚型的血清学调查

2.2 AIV H9N2 亚型贵州株的分离与鉴定

2.3 AIV H9N2 亚型贵州株 HA、NA 基因的克隆与序列分析

3 结果与分析

3.1 AIV H9 亚型的血清学调查结果

3.2 AIV H9N2 亚型贵州株的分离鉴定结果

3.3 AIV H9N2 亚型贵州株 HA 基因的克隆及序列分析结果

3.4 AIV H9N2 亚型贵州株 NA 基因的克隆与序列分析结果

4 讨论

4.1 关于贵州省 AIV H9 亚型的血清学调查

4.2 关于 AIV H9N2 亚型贵州株的生物学特性

4.3 关于 AIV H9N2 亚型贵州株 HA 基因的序列分析

4.4 关于AIV H9N2亚型贵州株NA基因的序列分析

5 结论

5.1 贵州省非免疫鸡群中已普遍存在 H9 亚型禽流感病毒的感染。

5.2 贵州省免疫鸡群 H9 亚型免疫抗体合格率达到 78.5%，免疫保护效果较好。

5.3 首次从贵州省成功分离到一株 H9N2 亚型 AIV，按国际通用流感病毒命名法将其命名为 A/Chicken/GuiZhou/01/2008（H9N2）。

5.4 HA 基因裂解位点处氨基酸排列顺序为 paRSSR↓GLF，符合低致病性 AIV 的分子生物学特征。

5.5 HA 基因、NA 基因的系统进化树分析表明，分离株属于欧亚种系，且均属于以香港分离株 A/Duck/HongKong/Y280/97 为代表的 Y280 分支。

致谢

参考文献

附录一 攻读硕士学位期间发表的论文

声明