镰刀菌酸诱导烟草悬浮细胞程序性死亡及其分子机制研究

摘要

镰刀菌酸(fusaric acid, FA)是由镰刀菌产生的一种非寄主选择性毒素，是镰刀菌致病的主要原因之一。程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。PCD现象在生物界中是普遍存在的，对植物而言，PCD不仅是植物体正常生长发育不可缺少的过程，而且是植物抵抗病原物侵染的重要机制之一。
　　 为研究FA能否诱导烟草悬浮细胞发生PCD，并进一步探索其分子机制，本试验以烟草悬浮细胞为材料，采用形态学、药理学、分子生物学和生物化学等方法，对FA诱导的烟草悬浮细胞死亡的形态变化、生化变化和信号途径等进行了观察和检测，所得结果如下:
　　 1.采用伊文思蓝染色法测定FA诱导的烟草悬浮细胞死亡率并在光学显微镜下观察细胞形态。结果显示:FA浓度增大，细胞死亡率升高，其中100μmol/L FA诱导24 h的细胞死亡率约为48％;光学显微镜下观察到活细胞不被染色，而死细胞被染成蓝色并且细胞质收缩。
　　 2.采用DAPI(4'，6-Diamidino-2-phenylindole)染色法在荧光显微镜下观察细胞核形态。结果显示:正常细胞的细胞核呈规则的圆形，染色质分布均匀;而细胞经100μmol/L FA诱导24 h后，细胞核拉伸变形，内有空洞，染色质分布不均匀。
　　 3.采用琼脂糖凝胶电泳分析法和原位末端标记法(terminal-deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling，TUNEL)检测DNA片段化。结果显示:正常细胞基因组DNA为一条完整的带，而100μmol/L FA诱导24 h的细胞基因组DNA有小片段形成;正常细胞TUNEL阳性核比例不足1％，而100μmol/L FA诱导处理24 h后约有31％的细胞呈现TUNEL阳性核，17％的细胞呈现坏死;当FA浓度增大至200μmol/L时，TUNEL阳性核比例降至23％，坏死细胞升至46％。
　　 4.采用透射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)观察细胞超微结构的变化。结果显示:100μmol/L FA诱导处理12h后，细胞发生质壁分离;液泡数目增多;细胞核异染色质凝聚并边集化;内质网池变大，核糖体脱落;线粒体双层膜被破坏，内嵴部分溶解。
　　 5.采用分子生物学和生物化学等方法检测FA诱导的烟草悬浮细胞死亡过程中的各项变化。结果显示:100μmol/L FA诱导处理细胞后，胞外过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)迅速积累，30 min后出现第一个峰值，2h后达到最大值;NADPH氧化酶抑制剂DPI能够抑制FA诱导的细胞死亡，其抑制率约为65％;胞内胞外一氧化氮(nitric oxide，NO)迸发，在一定范围内呈现浓度和时间依赖趋势;抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase，APX)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活性均降低;丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，膜脂过氧化作用增强;线粒体膜电位下降，ATP(adenosine triphosphate，ATP)含量降低，线粒体ATP合成酶特异性抑制剂寡霉素(Oligomycin)能够抑制FA诱导的细胞死亡，其抑制率为73.9％;类caspaSe-3蛋白酶活性被激活，12h时活性最高，约为对照的4.7倍。
　　 6.通过药理学方法检测NO在FA诱导的烟草悬浮细胞死亡过程中的作用。结果显示:NO合成酶抑制剂L-NMMA(NG-monomethyl-arginine monoacetate)和NO清除剂cPTIO(2-(4-Carboxyphenyl)-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide）能够抑制细胞死亡和类caspase-3蛋白酶的活性，且cPTIO的抑制作用大于L-NMMA; CaspaSe-3蛋白酶特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO(Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-aldehyde)预处理后也明显抑制了细胞死亡，其抑制率约为56％。
　　 7.通过RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测FA诱导的烟草防卫基因PAL和PCD相关基因Hsr203J的表达。结果显示，FA诱导了PAL和Hsr203J的表达，并且NO清除剂cPTIO和NO合成酶抑制剂L-NMMA能够抑制PAL和Hsr203J的表达。
　　 综合上述结果，得出以下结论:FA诱导的烟草悬浮细胞死亡具有PCD典型特征;APX和CAT活性下降，细胞抗氧化能力降低，导致H2O2积累，H2O2促进了膜脂过氧化的发生，导致细胞膜系统的破坏;线粒体的形态和功能变化（膜电位下降、ATP含量降低、膜脂过氧化和Oligomycin抑制试验）是导致FA诱导PCD的重要步骤;NO通过调控类caspase-3蛋白酶活性参与FA诱导的烟草悬浮细胞PCD过程;NO还可以影响烟草防卫基因和PCD相关基因的表达。

目录

声明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 细胞死亡分类

1．1．1 非程序性细胞死亡

1．1．2 程序性细胞死亡

1．2 PCD概述

1．2．1 PCD和凋亡概念的提出

1．2．2 PCD与细胞凋亡的区别

1．2．3 动物和植物PCD特征

1．3 植物PCD研究进展

1．3．1 植物生长发育过程中的PCD

1．3．2 环境胁迫下的PCD

1．3．3 植物PCD分子机制研究进展

1．4 镰刀菌酸概述

1．4．1 镰刀菌毒素的分类

1．4．2 镰刀菌毒素对植物细胞的影响

1．4．3 镰刀菌酸研究进展

1．5 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 生化和分子试剂

2．1．2 培养基的配制

2．1．3 试验用试剂和溶液的配制

2．1．4 烟草悬浮细胞培养

2．1．5 PCR引物

2．2 试验方法

2．2．1 烟草悬浮细胞的诱导处理

2．2．2 细胞死亡率测定

2．2．3 细胞核形态观察

2．2．4 细胞超微结构观察

2．2．5 细胞基因组DNA提取与分析

2．2．6 烟草悬浮细胞TUNEL检测

2．2．7 胞外H2O2含量测定

2．2．8 NO定量测定和定性测定

2．2．9 APX和CAT活性测定

2．2．10 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量

2．2．11 膜脂过氧化检测

2．2．12 烟草悬浮细胞线粒体分离纯化

2．2．13 线粒体膜电位检测

2．2．14 线粒体ATP含量测定

2．2．15 类caspase-3蛋白酶活性检测

2．2．16 烟草悬浮细胞总RNA的提取和纯度测定

2．2．17 RT-PCR分析烟草悬浮细胞的基因表达

3 结果与分析

3．1 不同浓度FA及处理时间对烟草悬浮细胞死亡的影响

3．2 FA诱导细胞死亡的形态特征

3．3 FA诱导细胞DNA片段化

3．4 FA诱导胞外H2O2积累及其对细胞死亡的影响

3．5 NO定量定性分析及其对细胞死亡的影响

3．6 FA诱导的APX和CAT活性变化

3．7 FA诱导的烟草悬浮细胞膜脂过氧化

3．8 线粒体参与FA诱导的烟草悬浮细胞死亡

3．9 NO抑制剂对FA诱导的类caspase-3蛋白酶活性的影响

3．10 NO抑制剂对烟草悬浮细胞基因表达的影响

4 讨论

4．1 FA诱导的烟草悬浮细胞死亡具有PCD的特征

4．2 FA诱导烟草悬浮细胞胞外H2O2积累并且影响细胞死亡

4．3 NO参与FA诱导的烟草悬浮细胞PCD

4．4 FA诱导烟草悬浮细胞抗氧化系统和细胞膜系统的破坏

4．5 线粒体参与FA诱导的烟草悬浮细胞PCD

4．6 类caspase-3蛋白酶参与FA诱导的PCD并受NO调控

4．7 NO参与调控FA诱导的烟草悬浮细胞基因表达

4．8 FA诱导植物细胞程序性死亡的分子机制

5 总结与展望

5．1 全文总结

5．2 研究展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况