人己糖胺酶D的酶学特性、生物底物及催化机制的研究

摘要

糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与生物体中的信号传导、细胞识别等多种细胞活动，糖苷酶是一类水解糖基辍合物糖苷键的水解酶，糖基缀合物的正常水解是生物体代谢的必需途径。糖基化修饰代谢异常与很多疾病密切相关，如家族黑蒙性白痴、山德霍夫氏病、Ⅱ型糖尿病、阿尔茨海默病和肿瘤等。人己糖胺酶D(HexD)是新发现的一种糖苷水解酶，但该酶的酶学特性、底物特异性及催化机制尚不清楚。
　　 本实验首先将HexD的cDNA序列构建到质粒pET3C中，重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3) plysS后，利用Ni-NTA亲和层析技术纯化出该酶，测定该酶最适pH、热稳定性和金属离子对该酶活性的影响。同时，利用生物信息分析同家族酶蛋白序列，找到两个可能的关键催化氨基酸，分别是148位的Asp和149位的Glu，通过氨基酸突变分析确定两者的催化作用。然后，通过HexD对多种底物如荧光底物、糖肽和糖脂的水解作用，与另外两种己糖胺酶HexA/HexB和OGA作对比，分析三种己糖胺酶底物特异性的异同点。最后，利用表达纯化出的HexD蛋白，制备HexD多克隆抗体。具体结果如下。
　　 成功构建了pET3C/HexD重组质粒，表达了大量的可溶性HexD蛋白。以4-甲基伞形酮-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(4-MU-O-GalNAc)为荧光底物，测定该酶的最适反应pH值为5.5，最适反应温度为37℃，且该酶的热稳定性较好，在50℃下放置半小时仍有较高活性。研究金属离子对该酶的影响发现，1mM的金属离子(CuSO4、FeSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、CaCl2、NiSO4·6H2O、AlCl3·6H2O、ZnSO4·7H2O、MnCl2)对该酶活性影响不大，不过10mM AlCl3、 CuSO4、FeSO4·7H2O对该酶有不同程度的抑制，其中Al3+抑制作用最强。通过对HexD序列中148位的天冬氨酸和149位的谷氨酸定点突变，我们发现将148位Asp突变为Glu和Asn之后，酶的活性彻底失去，而将149位的Glu突变为Asp和Gln之后，未发现酶活性的明显降低，表明HexD序列中Asp148为亲核氨基酸，Glu149为酸碱催化氨基酸。利用4-MU荧光基团连接的多种糖基化底物和糖肽水解实验，我们发现HexD偏好于水解O-β-GalNAc底物，为了探讨其在生命体中的底物，我们合成了β-GalNAc连接的糖脂，遗憾的是通过质谱、TLC方法未检测到HexD对该糖脂的水解活性。另外，利用大肠杆菌表达纯化出的HexD蛋白制备特异性多克隆抗体，Western blotting检测表明，该抗体特异性较高。溶酶体中存在的己糖胺酶:HexA/ HexB既能水解O-β-GalNAc结构的底物也能水解O-β-GlcNAc结构的底物;核质中存在的另一种己糖胺酶:OGA仅仅能水解O-β-GlcNAc结构的底物。

目录

声明

符号说明

摘要

1．前言

1．1 β-N-乙酰己糖胺酶

1．1．1 组织中β-N-乙酰己糖胺酶的生物学功能

1．1．2 β-N-乙酰己糖胺酶的分类

1．1．3 三类β-N-乙酰葡萄糖胺酶催化机制的联系和区别

1．2 糖基化修饰及其作用

1．2．1 糖基化修饰的类型

1．2．2 糖基化修饰的作用

1．3 糖基辍合物的降解

1．4 人的β-N-乙酰己糖胺酶

1．4．1 HexA和HexB

1．4．2 OGA

1．4．3 HexD

2．材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 实验主要仪器

2．1．4 主要试剂的配置

2．2 试验方法

2．2．1 pET3C／HexD重组质粒的构建

2．2．2 重组蛋白HexD的表达、纯化及活性检测

2．2．3 HexD酶学特性的研究

2．2．4 生物底物的探索

2．2．5 HexD抗体的制备及检测

2．2．6 HexD基因的点突变

3．结果与分析

3．1 HexD的表达和理化性质的分析

3．1．1 pET3C／HexD重组质粒酶切验证

3．1．2 HexD的诱导表达和纯化

3．2．HexD酶学特性的研究

3．2．1 HexD的最适pH值

3．2．2 HexD的热稳定性和最适反应温度

3．2．3 不同金属离子对HexD酶活的影响

3．3 生物底物的探索

3．3．1 对荧光外源性底物的水解

3．3．2 对糖肽的水解

3．3．3 对糖脂的水解

3．4 HexD抗体的制备及检测

3．5 HexD催化机制的初探

3．5．1 生物信息分析保守催化氨基酸

3．5．2 HexD基因的定点突变

3．5．3 HexD酶突变体酶活测试

4．讨论

4．1 HexD的表达和理化性质的分析

4．2 HexD酶学特性的分析

4．3 HexD生物底物的探索

4．4 HexD抗体的制备及检测

4．5 HexD催化机制的初探

5．结论

参考文献

致谢