细粒棘球蚴重组抗原铁蛋白和Eg10对小鼠骨髓来源树突状细胞的影响

摘要

目的：1.观察有保护力的细粒棘球蚴重组抗原Eg.ferrtin和无保护力的重组抗原Eg10刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)，通过研究BMDC形态、表面分子的表达的变化以及在不同抗原刺激下产生的免疫应答的差别，比较Eg.ferrtin和Eg10重组抗原诱导机体产生的免疫机制的差异。2.进一步探索寄生虫感染宿主的免疫基础理论，为我们寻找新的治疗靶点提供方向。
　　方法：1.获取可溶形式的细粒棘球蚴重组抗原 Eg.ferrtin和Eg10：重组表达质粒Eg10/pET-28aBL21(DE3)plysS和Eg.ferritin/pET-28aBL21(DE3)plysS在IPTG终浓度为0.2mmo l/L-1.0mmo l/L，在25℃、28℃、30℃、37℃等不同条件下诱导表达，摸索蛋白最佳表达条件；采用GSSH复性液对包涵体蛋白复性条件进行优化，观察蛋白复性情况。
　　2.小鼠BMDC与细粒棘球蚴重组抗原Eg.ferrtin和Eg10的体外共培养：以小鼠的骨髓细胞中的CD34+细胞作为前体细胞，联合细胞因子GM-CSF和IL-4共同刺激，隔天半量换，培养至第8天收集细胞即为小鼠BMDC；将培养的BMDC分为四组，一组加入细粒棘球蚴重组抗原Eg.ferrtin，一组加入细粒棘球蚴重组抗原Eg10，两组分别用0.1 ug/ml、1 ug/ml、10 ug/ml三种抗原浓度以及6 h,20 h,48 h不同的刺激时间，选取最佳的刺激浓度和刺激时间；一组加入LPS(50ng/ul)作为阳性对照组；一组任何物质都不加作为空白对照组。
　　3.BMDC形态学的观察：在扫描电镜、透射电镜下观察各组BMDC的外部结构和细胞内的超微结构，比较各组 BMDC表面树突的数目以及内部超微结构的变化。
　　4.BMDC表型的检测：应用流式细胞术测定各组BMDC的表面分子MHCⅡ、CD80、CD40、CD86的表达情况。
　　5.BMDC对T细胞增殖的影响：将四组小鼠BMDC分别混合同种异型T淋巴细胞培养，采用同种混合淋巴细胞反应的方法，比较各组BM DC诱导T细胞增殖的能力。
　　6.BMDC分泌的细胞因子水平的测定：收集四组BMDC的上清，用ELISA法检测各组BMDC分泌的IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α的水平。
　　结果：1.重组表达质粒Eg10/pET-28a和Eg.ferritin/pET-28a在IPTG终浓度为0.2mmo l/L-1.0mmo l/L，在25℃、28℃、30℃、37℃等不同条件下诱导表达，细粒棘球蚴重组抗原Eg.ferrtin和Eg10仍以包涵体的形式存在，采用GSSH复性液对包涵体蛋白进行复性，获得可观的可溶形式的细粒棘球蚴重组抗原Eg.ferrtin和Eg10。
　　2.建立小鼠BMDC体外培养的方法。每两只小鼠的骨髓细胞可以扩增约1-2x107个树突状细胞，BMDC纯度达到70％以上。
　　3. Eg.ferrtin体外刺激BMDC能使其成熟，且上调BMDC表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子的表达量，具有典型的成熟树突状细胞的形态，可诱导T细胞大量增殖；BMDC高表达IL-12、TNF-α等Th1型细胞因子，与空白对照组比，差异显著(P<0.01)。
　　4. Eg10体外刺激BMDC不能使其成熟，且中等程度表达MHC-Ⅱ类分子，下调共刺激分子表达量，诱导T细胞的增殖能力与对照组相比无差异。BM DC分泌的IL-6较高，与空白对照组比，有统计学意义(P<0.05)，IL-10的表达量与空白对照组比明显升高。(P<0.01)。
　　结论；1. Eg.ferrtin重组抗原能诱导BMDC成熟，刺激 T细胞的增殖和分化，经Eg.ferrtin刺激的BMDC高表达IL-12、TNF-α等细胞因子，推测有可能产生Th1型细胞介导的免疫应答，从而通过对病原体进行原始杀伤，达到清除入侵的病原体而保护机体的作用。
　　2. Eg10重组抗原不能诱导BMDC成熟，刺激T细胞的增殖的能力较弱，经Eg10刺激的BMDC表达的IL-6、IL-10等细胞因子的量较高，推测有可能产生Th2型免疫应答，引发免疫抑制的作用，从而有利于病原体的存活。

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前言

技术路线

（一）重组融合表达质粒Eg.ferritin/pET-28a和Eg10/pET-28a的表达、纯化

1 材料

2 方法

3.结果

（二）细粒棘球蚴重组抗原体外刺激小鼠骨髓来源树突状细胞的形态，表型和功能变化

1.材料和方法

2结果

讨论

结论

参考文献

文献综述

综述参考文献

致谢

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