快速鉴别诊断不同亚型鸭肝炎病毒的多重RT-PCR检测方法的建立和应用

摘要

鸭病毒性肝炎（duck viral hepatitis，DVH）是由鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)引起雏鸭的一种发病急、死亡快、死亡率高的疾病，主要感染3周龄以内的雏鸭剖检病变主要存在于肝脏。根据2009年的国际病毒分类委员第十次分类报告，将DHV分为鸭甲肝病毒(DHAV)，鸭星状病毒1型(DAstV-1)，鸭星状病毒2型(DAstV-1)三个血清型。同时，DHAV又包括三个基因亚型或血清亚型，分别称为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。鸭肝炎病毒的三个血清型及鸭甲肝病毒三个亚型之间均没有明显的抗原交叉保护，给鸭肝炎病毒的防治带来了很大的困难。DHAV-1一直是我国流行的优势血清型，但近年来DHAV-3在我国广泛流行，甚至一些地区出现DHAV-1和DHAV-3共流行的现象，DAstV-1在我国的出现由进一步增加了鸭病毒性肝炎的防治难度。本研究建立了可以快速鉴别诊断不同亚型鸭肝炎病毒单纯或混合感染的多重RT-PCR方法，并对2011年从山东，四川，河南，广东四省随机采集的病料以及2012年从山东省不同鸭场采集的病料进行了鉴别诊断。本研究共分为三个部分:
　　 1、鸭星状病毒WF1201株的分离鉴定及全基因组测序与分析
　　 参照GenBank中已发表的DAstV-1全基因组序列设计了两对DAstV-1检测引物，并建立了相应的RT-PCR方法。应用这两对检测引物分别对四川和山东采集的24份临床病料进行了DAstV-1的检测，其中9份检测出DAstV-1。将DAstV-1阳性病料研磨后接种9日龄鸭胚和1日龄雏鸭，结果接种鸭胚未见死亡，胚体也无明显病变，但大部分鸭胚的尿囊液呈绿色或黄绿色，应用建立的RT-PCR方法从接种的鸭胚中均检测到了DAstV-1。雏鸭接种后，有20％的雏鸭在48h内出现了神经症状，继而死亡，死亡鸭剖检可见肝脏肿大有出血点，其余鸭饲养1周均未见死亡。根据GenBank中已发表的DAstV-1全基因组序列设计了10对重叠引物和2对Reace-PCR引物，对WF1201株DAstV-1进行了全基因组扩增和序列测定。测序结果表明，该株毒具有星状病毒基因的典型特征:在RF1a和ORF1b的重叠区存在一个7碱基滑动序列AAAAAAC，其下游存在一个可配对形成颈环结构的序列。序列分析结果表明该毒株与江苏分离株C-NGB的亲缘关系较近，全基因组核苷酸具有98.7％的同源性。WF1201株DAstV-1全基因组序列传至GenBank，收录号为JX439643。
　　 2、鸭甲肝病毒1型和3型双重RT-PCR方法的建立及应用
　　 根据GenBank中已发表的72株DHAV-1和20株DHAV-3的全基因组序列，选择各自保守区设计合成了2对特异性引物。应用这2对引物，分别建立了检测DHAV-1
　　 和DHAV-3的单重RT-PCR方法，并对引物特异性进行了验证。在单重RT-PCR技术的基础上，建立了检测DHAV-1和DHAV-3共感染的双重RT-PCR检测方法。特异性检测结果表明该方法特异性强，只针对DHAV-1和DHAV-3进行特异性扩增，而对禽流感病毒(H9N2)、新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、鸭疫李默氏杆菌和大肠杆菌等其他鸭常见病原微生物均无扩增。敏感性检测结果表明该方法灵敏度高，最低可检测到10 pg的鸭肝组织总RNA和102个拷贝的病毒RNA。应用该方法对从山东，河南，四川，广东四个省26个鸭场的60份疑似鸭病毒性肝炎的临床样本进行检测，其中检测到DHAV-1和DHAV-3的混合感染23(38.3％)例，DHAV-1的单纯感染11(18.3％)例，DHAV-3的单纯感染18(30％)例，阴性样本8(13.3％)例。
　　 3、鸭甲肝病毒1型、3型和鸭星状病毒1型的多重RT-PCR检测方法的建立及应用
　　 根据GenBank中已发表的DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1的基因组序列，选择保守区设计合成了3对引物。应用这3对引物，分别建立了检测DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1的单重RT-PCR方法，并对其特异性进行了验证。在单重PCR的基础上建立了同时检测这三种病毒的多重RT-PCR检测方法。特异性检测结果表明该方法特异性强，只针对DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1进行特异性扩增，而对禽流感病毒(H9N2)、新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌等其他鸭常见病原微生物均无扩增。灵敏度检测结果表明该方法灵敏度高，最低可检测10 pg的鸭肝组织总RNA和102个拷贝的病毒RNA。该方法首次实现了对我国目前流行的所有亚型的DHV同时进行快速鉴别诊断。应用该多重PCR方法对山东不同鸭场采集的90份1～2周龄死亡的雏鸭肝脏组织样本进行了鉴别诊断，其中有48(53.3％)份样品为DHV阳性。这48份样本中有8份为DHAV-1和DHAV-3混合感染，3份为DHAV-3和DAstV-1混合感染，11份为DHAV-1单纯感染，18份为DHAV-3单纯感染，8份为DAstV-1单纯感染。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 DVH的病原类型

1．2 DHV的流行历史

1．3 DHV病原特性

1．3．1 DHAV

1．3．2 DAstV-1

1．3．3 DAstV-2

1．4 流行病学

1．4．1 DHAV

1．4．2 DAstV-1

1．4．2 DAstV-2

1．5 DHV的基因组结构

1．5．1 DHAV

1．5．2 DAstV

1．6 DVH的诊断

1．6．1 临床初步诊断

1．6．2 病毒的分离

1．6．3 实验室诊断技术

1．7 DVH的预防与治疗

1．7．1 DVH的预防

1．7．2 治疗

1．8 多重PCR技术

1．9 多重PCR技术在鉴别诊断DVH中的应用

1．10 本研究的目的和意义

2．材料与方法

2．1 DAstV-1 WF1201株的分离及全基因组测序

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 鸭甲肝病毒1型和3型双重RT-PCR检测方法的建立及应用

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1多重RT-PCR检测方法的建立及应用

2．3．1 材料

2．3．2 方法

3 结果与分析

3．1 DAstV-1 WF1201株的分离及全基因组测序

3．1．1 病毒的增殖

3．1．2 目的片段检测结果

3．1．3 测序结果拼接与分析

3．1．4 进化树的构建与分析

3．1．5 序列登陆GeneBank

3．2 鸭甲肝病毒1型和3型双重RT-PCR检测方法的建立及应用

3．2．1 DHAV-1和DHAV-3的增殖

3．2．2 单重RT-PCR

3．2．3 引物的特异性

3．2．4 双重RT-PCR

3．2．5 双重RT-PCR特异性试验

3．2．6 双重RT-PCR敏感性试验

3．2．7 临床样本检测

3．3 DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1多重RT-PCR检测方法的建立及应用

3．3．1 单重RT-PCR

3．3．2 引物的特异性

3．3．3 多重RT-PCR

3．3．4 多重RT-PCR特异性试

3．3．5 多重RT-PCR敏感性试验

3．3．6 临床样本检测

4 讨论

4．1 DAstV-1 WF1201株的分离及全基因组测序

4．2 鸭甲肝病毒1型和3型双重RT-PCR检测方法的建立及应用

4．3 DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1多重RT-PCR检测方法的建立及应用

5 结论

参考文献

附录一 DAstV-1 WF1201株全基因组序列

致谢

攻读硕士学位期间发表论文情况