微小血管参与糖尿病加重脑缺血损伤的实验研究

摘要

目的:观察糖尿病/高血糖状态脑缺血后，微血管数量、形态和内皮细胞的结构改变，明确微血管改变在糖尿病/高血糖加重脑缺血损伤中的作用及可能的机制，进一步探讨糖尿病/高血糖加重脑缺血损伤的可能机制。
　　方法:本实验选取雄性SD大鼠（260-300g），随机分成糖尿病脑缺血组（DM组）、糖尿病假手术组（DS组）、正常血糖脑缺血组（NM组）和正常血糖假手术组（NS组），腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制备1型糖尿病大鼠模型，血糖恒定高于16.7mol/ml为模型成功；正常血糖组给予等体积生理盐水腹腔注射。大脑中动脉阻塞（MCAO）法制备局灶性脑缺血模型（缺血30min）。再灌注1d，3d，7d，14d，28d时，采用 Longa评分法进行大鼠神经功能评分后断颈取脑；取前囟前2mm至前囟后3mm间脑组织行连续冠状取材（厚3mm），将脑组织片于4％多聚甲醛固定用于HE和免疫组化染色；梗死区周边大脑皮质取材，-80℃冻存，用于western-blotting检验，同时，提取相应区域脑组织置于2.5％戊二醛固定，用于电镜检查。 HE和PAS染色观察脑缺血后不同灌注时间微小血管的损伤和再生；透射电子显微镜观察脑缺血再灌注1d、3d、7d时血管内皮细胞和基底膜的形态学改变；连同内皮细胞功能蛋白vWF免疫组化染色，共同观察缺血再灌注过程中微小血管的损伤和再生情况。免疫组化和western-blotting法检测缺血再灌注不同时段各组缺血周边区 VEGF和VEGFR2的表达，并进一步将VEGF和星形胶质细胞特异性标记GFAP和神经元特异性标记NeuN分别进行免疫组化荧光双标，进一歩明确VEGF神经细胞定位。从而，进一步阐明糖尿病/高血糖对脑缺血再灌注微小血管影响的可能分子机制，为高血糖加重脑缺血损伤的防治提供新思路。
　　结果:高血糖组梗死灶体积明显大于正常血糖组（P＜0.05）。组织学观察结果显示：假手术组结构基本正常，MACO30 min再灌注1d时，缺血侧血管管腔增大，血管和神经细胞周围间隙增大。缺血区出现神经元肿胀，部分神经元出现核固缩，DM组以上脑水肿和神经细胞损伤的表现更加明显。再灌注3d时，以上脑水肿程度减轻，缺血灶边缘微小血管数量增加，管腔大而不规则；再灌注7d时，血管数量较3d减少，形状逐渐恢复正常，缺血灶胶质细胞大量堆积，胶质结节形成；至再灌注28d时，缺血区血管无论数量或形态，与正常组比较，无明显差异。与NM组相比较，DM组缺血侧微小血管的随再灌注时间的延长，数量变化趋势相似，但再灌注3d和7d时，缺血侧边缘血管数量明显增多，再生的血管呈簇状排列，部分血管管壁缺如，结构不良。PAS结果显示：再灌注1d时血管管腔变大，基底膜变薄，较正常染色变浅，3d时，再生的血管形状不规则，基底膜染色浅，部分基底膜断裂，7d时基底膜开始增生、部分区域变厚，染色较1d、3d加重；再灌注14d时，血管基本恢复，基底膜较正常血管略增厚，基底膜相对完整，PAS染色加深。与NM组相比较，DM组再灌注1d时，基底膜PAS染色明显变淡，基底膜厚薄不一现象明显，有些区域甚至出现染色不连续。再灌注7d后，血管形状多数不规则，基底膜染色淡，部分区域缺如。电子显微镜观察可见，DM组和NM组血管内皮细胞均出现不同程度的受损情况。在DM1d时，内皮细胞形成凋亡小体，基底膜内出现大量空泡；再灌注3d时，新生血管管腔不规则，基底膜厚薄不一；再灌注7d时，血管壁呈增生样增厚，血管周边空泡较1、3d组明显减少。血管壁的内皮细胞和构成血管壁的星形胶质在缺血再灌注1d时，细胞明显水肿，内质网和线粒体明显肿胀，甚至出现细胞器崩解，以后逐渐恢复。高血糖组血管内皮的受损情况较NM明显加重，血管壁周边空泡明显增多、变大，内皮细胞凋亡明显，基底膜厚薄不一更加明显，其内空泡大而易见，甚至出现基底膜断裂，损伤表现以再灌注1d最为明显。DM组缺血后内皮细胞和星形胶质细胞细胞器损伤同样明显加重。内皮细胞功能蛋白vWF免疫组化结果显示：假手术组内皮细胞内可见vWF均匀高强度表达，在NM组1d时，表达明显下降，再灌注3d和7d时血管内皮细胞又出现不同程度表达，至缺血再灌注28d后，血管内皮阳性表达量恢复至正常状态。与NM组比较，DM组各灌注时间点内皮细胞vWF表达明显减弱。免疫组化结果显示：VEGF主要定位于微小血管内皮细胞和神经细胞胞浆，VEGFR2主要定位于内皮细胞。假手术组鼠脑中仅见微量VEGF表达，DM组和NM组脑组织VEGF阳性表达主要分布于缺血周边区,VEGFR2阳性表达主要分布于缺血周边区的血管内皮细胞。NM组和DM组大鼠脑组织中VEGF表达均较正常对照组明显增加(P<0.05)。VEGF表达于再灌注1d开始升高，至3d达到高峰，随后逐渐降低，随时间延长其表达逐渐减少；至第28天仅有少量表达。与NM组相比，DM各灌注组VEGF阳性表达明显降低(P<0.05)。Western Blotting结果显示：VEGF和VEGFR2蛋白于正常血糖脑缺血再灌注组及假手术组表达较少，自第3d有一定量的表达，第7天表达最多，之后逐渐减少，至28天仍有表达（P<0.05）。通过VEGF和GFAP和Neun免疫组化荧光双标结果提示，VEGF在星形胶质细胞和神经元均有高表达。
　　结论:1.糖尿病/高血糖能加重脑组织损伤，加大梗死灶面积及微小血管损伤；微小血管损伤包括：内皮细胞损伤，基底膜损伤和星形胶质细胞的损伤，参与了糖尿病/高血糖加重脑缺血损伤；
　　2.糖尿病/高血糖可促进缺血再灌注过程中微小血管增生，但增生的血管呈簇状生长，结构不完整，可能与糖尿病/高血糖状态，脑缺血预后不良有关；
　　3.脑缺血再灌注损伤可诱导VEGF、VEGFR2的早期表达，参与了脑缺血损伤微小血管的再生；
　　4.糖尿病/高血糖状态脑再灌注损伤时VEGF和VEGFR-2蛋白表达量的减少，可能参与了糖尿病/高血糖导致的再灌注过程中再生微小血管的结构不良。

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前言

材料与方法

1.材料

2．实验方法

结果

1.一般情况

2.缺血后脑组织形态学改变

3.糖尿病/高血糖对缺血后微小血管的影响3.1血管数量及形态的改变

4.内皮细胞功能蛋白vWF的表达

5.脑缺血再灌注后VEGF和VEGFR-2的表达结果

讨论

1. 糖尿病/高血糖可以加重脑缺血损伤

2. 糖尿病/高血糖加重了缺血早期微小血管的损伤，导致了缺血恢复期血管结构不良

3. 糖尿病/高血糖可能加重了内皮细胞功能损伤，减缓了其功能恢复

4. VEGFR1和VEGFR2参与了糖尿病/高血糖脑缺血时微小血管的改变

结论

参考文献

文献综述糖尿病脑缺血血管新生机制的研究进展

1.脑缺血再灌注损伤的分子机制和影响因素

2.高血糖脑缺血再灌注后血管内皮损伤的分子机制

3.脑缺血损伤与血管新生机制的研究

4.血管新生的影响因素

文献综述参考文献

致谢

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