鸭甲肝病毒1型在鸭胚及细胞传代中的变异规律研究

摘要

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是雏鸭的一种传播迅速、高度致死的病毒性传染病，由鸭甲肝病毒(Duck hepatitisAvirus，DHAV)和鸭星状病毒(Duck astrovirus,DAstV)引起，主要感染3周龄以内的雏鸭。近年来，由于各地不断有DHAV的变异株出现，使得用传统的DHAV弱毒苗免疫种鸭或雏鸭未能获得满意的免疫效果，对养鸭业造成了严重的影响，而鸭甲肝病毒的变异机理尚不清楚。VP1蛋白作为主要的衣壳蛋白，编码病毒主要的保护性抗原位点，包含与细胞受体相互作用的序列和主要的型特异性中和位点，具有最大的遗传多样性。3D蛋白编码RNA聚合酶，RNA聚合酶对病毒的增殖复制有非常重要的作用。为了解鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)VP1基因的变异规律，本研究选择在鸭胚及细胞上对病毒进行传代试验，通过对VP1及3D基因的克隆测序及毒力的测定，为深入了解DHAV-1的遗传变异规律提供依据。
　　1.DHAV-1 LY0801在鸭胚上的传代试验
　　为了解1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)在鸭胚传代中的变异规律，本研究将LY0801株DHAV-1及4株潍坊DHAV-1分离株A3，A4，A5和A6在鸭胚体内进行传代至30代，分别对LY0801的1-5、10、15、20、25、30代病毒进行VP1基因的克隆测序，每隔5代对LY0801的3D基因及A3，A4，A5和A6的VP1基因克隆测序。利用本实验室李井新等建立的实时荧光定量RT-PCR方法对每代LY0801的RNA进行定量，各代次病毒分别以108copies/胚接种9日龄健康鸭胚，测定各组鸭胚的平均死亡时间和病毒在鸭胚尿囊液中的增殖拷贝数。结果表明，5株DHAV-1分离株在鸭胚上的变异规律并不一样，其中三株(LY0801、A3和A4)出现类似的不同代次中12个氨基酸变异位点同步变异和反复变异现象，分别为R43（→）M43/K43, T48（→）A48, T101（→）S101, L169（→）F169, T180（→）I180, S181（→）L181, R183（→）Q183,E184（→）A184/k184，G187（→）D187，D193（→）N193，M213（→）R213，H219（→）Y219;而另外两株(A5和A6)则发生突变后非常稳定，传至第30代时只有第43位氨基酸出现变异:M43（→）K43，没有出现反复变异现象，这说明DHAV-1不同毒株在鸭胚传代过程中的适应与变异与毒株的特异性有直接关系。但是LY0801的3D蛋白比较保守，没有出现有规律的突变。在传代过程中，LY0801致死鸭胚的时间逐渐延迟，实时荧光定量RT-PCR检测表明，不同代次DHAV-1鸭胚尿囊液的病毒含量差异显著，且并未呈现出适应鸭胚后病毒拷贝数逐步稳定增加的趋势，但每一代病毒在不同时间致死鸭胚的病毒粒子拷贝数相近。以上结果表明DHAV-1 LY0801株的毒力和增殖能力与VP1及3D的突变没有直接的关系。
　　2.DHAV-1 LY0801在细胞上的传代试验
　　由于鸭胚在研究病毒的致病机理和分子生物学等方面具有一定的局限性，而细胞培养模型是开展病毒基础研究的良好平台，我们将DHAV-1在BHK-21上传代，以期为将来研究DHAV-1的生物学信息提供一些有价值的参考信息。将经0.22μm滤器过滤的DHAV-1尿囊液接种在BHK-21细胞表层，72 h后收获接毒的细胞培养物，按常规连续盲传5次。分别进行总RNA提取和RT-PCR鉴定以及间接免疫荧光(IFA)鉴定，确定传代细胞系为BHK-21。依此连续传代30代。每隔5代对VP1基因进行DNA序列测定。在细胞传代过程中，LY0801株DHAV-1的VP1出现了与鸭胚相同的12个氨基酸变异位点相同，同步变异，但是并未出现出现反复变异现象。荧光定量RT-PCR表明，细胞传代病毒在每一代的含量比较稳定，平均为7.94×103 copies/μl，并没有显著的上升规律，且含量明显低于尿囊液病毒含量。