莱芜猪和大白猪背最长肌miRNA与mRNA转录组测序及特征分析

摘要

猪不但可以作为重要的农业经济动物为人类提供大量的肉类产品，而且还可以作为模式生物用于医学研究。由于遗传背景及人工选育方式的不同，造成了中外猪种在生产性状方面存在很大的差异。比如，莱芜猪作为我国特有的猪种资源，具有肉质优良的种质特性;而西方猪种虽然在生长速度方面具有优势，但是其较差的肉品质已不满足于消费者的需求。大量研究证实中外猪种间种质差异的形成与基因的差异表达有关，因此，从转录组水平探索中外猪种骨骼肌差异表达基因，对于解析品种间的差异及揭示形成该差异的分子机理具有重要作用。
　　本研究选用生长速度慢但肉质优良的莱芜猪(Laiwu pig，LW)和生长速度快但肉质较差的大白猪(Yorkshire，YS)作为试验动物，利用高通量测序技术分析了莱芜猪与大白猪骨骼肌中的差异表达miRNA与差异表达基因，并对差异表达miRNA与基因进行筛选及信号通路富集，分析差异miRNA与差异基因在中外猪种中的功能。对于差异表达miRNA，采用生物信息学软件预测了这些miRNA可能的靶基因，构建了差异表达miRNA的调控网络图。为了验证高通量测序结果的正确性，我们采用qRT-PCR方法对差异表达miRNA与差异基因进行了定量验证，结果表明，高通量测序结果比较可靠。本研究的主要结果如下:
　　(1)莱芜猪与大白猪骨骼肌小RNA测序分析
　　分别构建了3个莱芜猪与3个大白猪的背最长肌小RNA文库，并利用RNA-seq技术对6个小RNA文库进行了测序，分析miRNA在莱芜猪与大白猪中的表达模式。结果表明，平均在每个莱芜猪的小RNA文库中获得了13，493，607的纯净测序reads，大白猪约为12，938，257。总共筛选出265个已知miRNA，其中有229个在6个文库中都表达;另外，还预测到94个新miRNA。对筛选出的359个miRNA进行表达分析，结果发现ssc-miR-1在两个品种猪中都是表达量最高的，而ssc-miR-194b-5p在两个品种猪中的差异倍数最大（6.35倍）;此外，还发现有25个miRNA在莱芜猪与大白猪骨骼肌中是显著差异表达(q＜0.05)。在25个差异显著的miRNA中，有10个miRNA在莱芜猪中上调表达，15个下调表达。为了验证测序结果的准确性，随机选取了16个miRNA进行qRT-PCR验证，qRT-PCR结果与测序结果基本一致。对差异表达miRNA的靶基因进行预测，结果获得了10，806个靶基因，而这些靶基因主要被富集到代谢过程等信号通路中。
　　(2)莱芜猪与大白猪骨骼肌mRNA转录组测序分析
　　为了研究莱芜猪与大白猪骨骼肌全基因组的转录谱，利用RNA-seq技术对构建的两个品种猪骨骼肌文库进行测序，测序结果显示在莱芜猪的文库中获得了40，498，476的测序reads，大白猪为59，072，892;其中，80％以上的测序reads可以比对到猪的基因组中。在两个文库中共检测到12种选择性剪切类型分析，其中以TSS（转录起始位点）与TTS（转录终止位点）两种剪切类型所占的比例最大，分别占到43％和40％以上。通过对测序reads进行比对分析，结果显示在莱芜猪与大白猪骨骼肌中有10，482个共表达基因，另有739个基因只在莱芜猪中表达，712个基因只在大白猪中表达。在两个品种猪中总共预测得到1，678个新基因，其中对应2，229个新转录本。为了更进一步研究这些差异基因的功能，对这些差异基因进行检验分析，结果表明在莱芜猪与大白猪骨骼肌中有178个显著差异表达的基因(q＜0.05)，其中，相对于大白猪，在莱芜猪中有98个差异基因为上调表达，80个下调表达。为了验证这些差异基因的正确性，随机选取了12个差异表达基因进行qRT-PCR验证，测序结果与qRT-PCR结果基本一致，两者具有很强的相关性(R2=0.93)。对差异表达基因进行功能注释，发现差异表达基因主要被富集到代谢通路，尤其是与脂肪代谢相关的信号通路，比如脂肪酸合成代谢通路等。
　　(3)骨骼肌差异miRNA与差异基因关联分析
　　为了从整个转录水平了解两个品种猪差异表达miRNA及差异基因的功能，对178个差异表达基因与25个差异表达miRNA进行关联分析，结果表明只有10个miRNA在关联分析中达到显著水平(q＜0.05)，上调表达4个、下调表达6个。关联分析结果表明，6个下调miRNA对20个上调差异表达基因具有调控作用;4个上调miRNA对20个下调表达差异基因具有调控作用。
　　综上所述，本研究从miRNA和mRNA两个水平系统研究了两个品种猪骨骼肌差异表达基因，并对这些差异表达基因进行了功能注释、通路分析及互作网络调控分析等;并采用qRT-PCR方法验证了部分差异基因的表达水平。为研究不同表型猪的比较转录组学提供了宝贵的遗传资源与材料，并且有助于提高对猪转录组遗传结构的认识和理解。