樱桃锉叶病毒及樱桃叶斑驳病毒抗血清的制备和应用

摘要

樱桃锉叶病毒（Cherry rasp leaf virus，CRLV）以及樱桃叶斑驳病毒（Cherry mottleleaf virus，CMLV）是樱桃上两种重要的病害，侵染樱桃后，CMLV可造成樱桃叶片扭曲，产生坏死性斑点，CRLV可在叶片背面产生耳状突起，两者均可使果实变小、萎蔫，严重的还可导致整片果园绝产。
　　本研究利用两种病毒的外壳蛋白分别制备了这两种病毒的三种抗血清，对于加强樱桃病毒病的检测和控制，防止病毒病的发生和传播扩散具有重要意义。构建重组表达载体pGEX-CMLV-CP、pGEX-VP25以及pGEX-VP24，将重组质粒转化至BL21(DE3) Plys，IPTG诱导后得到与预期大小一致的目的蛋白。利用GST标签试剂盒纯化之后，免疫家兔获得抗血清。由ID-ELISA方法抽样检测山东济宁地区樱桃果园内樱桃锉叶病毒和樱桃叶斑驳病毒的感病情况得出CMLV及CRLV的感染率均为7.14％，复合感染率约为3.57％。Western blot的工作浓度为1∶1000时，验证知所制备的抗血清可以和诱导表达的蛋白产生反应，同时也可和抗原病汁液产生特异性反应。使用感病样品叶片作为抗原测定免疫家兔获得的抗血清效价，三种蛋白CRLV-VP24、CRLV-VP25以及CMLV-CP抗血清效价分别为1∶4096、1∶4096和1∶512。将RT-PCR扩增得到CRLV的VP24、VP25基因以及CMLV的外壳蛋白CP基因，成功克隆到pMD18-T上，转化E.coli DH5a，获得重组质粒后，测定插入序列，通过正反向两次测序分析分析表明，扩增得到的CMLV和CRLV目的基因，核苷酸序列长度分别为579bp(vp24)、657bp(vp25)、579bp(cmlv-cp)。经BLAST和系统进化树分析表明vp25和vp24与加拿大分离物AY122330.2核苷酸同源性最高达100％，与美国分离物J621358.1核苷酸同源性达到86％。而cmlv-cp，与已报道的加拿大分离物AF170028.1核苷酸同源性高达100％，与另一美国分离物KC207480.1的核苷酸同源性达到85％。