线粒体膜通透性转换在铅诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用

摘要

铅(Pb)是环境中常见的蓄积性毒物，对机体的损伤呈多系统性和多器官性。肾脏是铅毒性作用的重要靶器官之一，而肾小管是铅肾毒性的敏感作用靶点。前期研究发现细胞凋亡在Pb诱导大鼠肾小管上皮(rPT)细胞损伤过程中发挥主导作用，体内实验证实线粒体功能异常参与了Pb诱导的rPT细胞损伤。线粒体是细胞凋亡信号转导途径中起关键作用的细胞器，它作为内源性通路的中心环节参与调控细胞凋亡;但线粒体凋亡途径在Pb染毒所致rPT细胞毒性损伤过程中的作用机制尚不明确。线粒体途径介导细胞凋亡的发生最终归结于线粒体膜通透性转换(MPT)，MPT的发生是由线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放所致。MPTP由外膜蛋白电压依赖性阴离子通道(VDAC)、内膜蛋白腺嘌呤核苷酸转位酶(ANT)和线粒体基质蛋白亲环蛋白D(Cyp-D)组成，各蛋白表达及基因转录水平在调控细胞凋亡及MPTP的开关中发挥重要作用。因此，Pb染毒对rPT细胞中MPTP各组成蛋白翻译水平及编码基因转录水平的影响及各蛋白在Pb诱导MPTP开放与细胞凋亡中的作用是本研究拟解决的核心问题。
　　本课题首先采用透射电镜对Pb染毒12h的rPT细胞进行了线粒体超微结构观察，发现Pb染毒使rPT细胞线粒体超微结构发生显著变化，表现为线粒体肿胀、嵴断裂或消失、膜溶解等，其损伤程度呈剂量依赖性。通过激光共聚焦显微镜分析MPTP开放情况，结果表明Pb染毒可导致rPT细胞MPTP显著开放，且呈剂量依赖效应。我们采用免疫印迹分析法和定量PCR法分别对VDAC、ANT和Cyp-D各蛋白的翻译水平和相应蛋白所编码基因的转录水平进行了检测，发现:①Pb染毒组中VDAC-1和ANT-1蛋白表达水平极显著高于对照组(P＜0.01)，其蛋白所编码基因的转录水平与蛋白翻译水平结果一致(P＜0.01)，均呈剂量依赖效应;②Pb染毒使rPT细胞的Cyp-D、VDAC-2、ANT-2各蛋白表达水平及其编码基因转录水平均显著或极显著低于对照组(P＜0.05，P＜0.01)，且呈剂量依赖效应;③VDAC-3在铅染毒过程中变化不显著，仅1μM Pb可使其蛋白表达水平和基因转录水平显著高于对照组水平(P＜0.05)。此外，我们采用MPTP组成蛋白的特异性抑制剂DIDS(VDAC抑制剂)、BA(ANT抑制剂)和CsA(Cyp-D抑制剂)对染毒细胞进行处理，并通过流式细胞仪检测各抑制剂对Pb染毒所致细胞凋亡率的影响，结果表明3种抑制剂均可极显著降低Pb染毒所致细胞凋亡率(P＜0.01)，且3种抑制剂自身对细胞凋亡率无显著影响（P＞0.05）;其中以CsA抑制凋亡效果最显著。
　　结合上述研究结果，我们可以得出如下结论:①Pb染毒导致rPT细胞线粒体损伤且发生线粒体膜通透性转换（MPTP开放），证实线粒体凋亡途径参与了Pb所致rPT细胞毒性。②Pb染毒使MPTP组成蛋白翻译水平及编码基因转录水平呈现不同的变化趋势，其中VDAC-2、ANT-2和Cyp-D在染毒后蛋白表达及基因转录水平均显著降低，这主要与3种蛋白的细胞保护效应、抗凋亡活性、维持线粒体膜电位功能及MPTP关闭的特性直接相关;Pb作为氧化应激源激活了VDAC-1与ANT-1蛋白活性及基因转录水平，二者作为促凋亡蛋白可进一步加重细胞凋亡并开启MPTP;染毒过程中VDAC-3变化不显著可能与其在线粒体呼吸功能中的作用微弱相关，因该蛋白在活性氧产生过程中的调控作用很小。③VDAC关闭可直接促使MPT的发生，DIDS通过介导VDAC开放而显著降低细胞凋亡率，表明Pb可导致rPT细胞VDAC关闭，后者进一步促使MPT的发生而触发细胞凋亡。BA通过改变ANT构象来阻止其与Bax蛋白的二聚化而拮抗细胞凋亡，表明铅可导致ANT构象改变来介导细胞凋亡。CyP-D是CsA抑制MPTP孔的唯一靶点，CsA可极显著抑制Pb介导的细胞凋亡，进一步证实了MPT在Pb所致rPT细胞凋亡中的作用。