规模化奶牛养殖场布鲁氏菌病血清学调查与间接ELISA检测方法的建立

摘要

近年来，我国奶牛养殖业发展势头迅猛，奶牛养殖正朝向规模化和集约化方向发展，奶牛布鲁氏菌病引发的流产等各种问题在规模化牧场中日益严重。缺乏奶牛布鲁氏菌病的流行病学数据是我国控制牛布鲁氏菌病的重要障碍之一。布鲁氏菌第一组外膜蛋白omp10、omp16和omp19被证明为良好的免疫原性，是亚单位疫苗的热门候选，是重要的毒力蛋白;本实验拟利用实验室保存的第一组外膜蛋白作为诊断抗原，建立一种针对牛血清布鲁氏菌抗体的间接ELISA检测方法。
　　自2011年1月-2013年6月，实验室收到送检和采集的全国范围内的规模化奶牛养殖场血样样本进行虎红平板凝集实验，对养殖场大群和流产奶牛进行初步的筛查。将实验室保存的质粒pEASY-T3-omp10、pEASY-T3-omp16和pEASY-T3-omp19经克隆、酶切、鉴定，重新连接pET-32a(+)表达载体，通过大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白pET-32a-omp10、pET-32a-omp16和pET-32a-omp19，经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后，采用Ni-NTA Spin Kit纯化重组蛋白，分别利用纯化获得的重组蛋白进行包被，尝试构建几种间接ELISA检测方法，成功建立的方法进行临床血清的检测（实验室保存的251份临床血清），检测结果与RBPT进行对比，判断建成方法的特异性、敏感性和准确性。
　　虎红检测奶牛血清样本共计5575份，阳性血清1036份，占检测样本总数的18.58％。其中，群检奶牛血清样本4980份，阳性样本792份，虎红阳性率为15.90％;流产奶牛血清样本595份，阳性样本244份，虎红阳性率为41.01％。成功表达纯化重组蛋白omp10、omp16和omp19，以omp16为包被抗原建立的iELISA检测方法具有稳定性好、灵敏度高的特点，与虎红平板凝集试验的符合率可达86.57％;而omp10和omp19在方法建立的过程中出现阳性血清不同梯度OD值差异不大，阴性血清OD值与梯度无关的情况，阴阳性血清的OD450值的商值(P/N)差异很小（小于1），无论如何改变抗原和血清稀释度，这一情况都没有得到改善，故omp10和omp19未能成功构建检测方法。
　　全国范围内，布鲁氏菌病的发病情况比较严重，而且范围很广，呈现上升趋势，布鲁氏菌病引起的奶牛流产，在各种流产因素中占据很大比例。成功构建的omp16 iELISA方法稳定、可靠，可作为奶牛布鲁氏菌病血清学候选方法，同时为omp16免疫原性和抗感染保护作用的进一步研究奠定了基础;omp10和omp19不适合作为iELISA检测抗原，其免疫机制有待进一步研究。