miR-125b靶向调控DNMT3b介导p53 DNA甲基化在Hcy致血管平滑肌细胞增殖的作用研究

摘要

目的：观察同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)对血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)p53甲基化程度的影响，明确DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase3b, DNMT3b)是否对p53甲基化有调控作用；观察Hcy对血管平滑肌细胞miR-125b表达的影响，确定miR-125b是否与DNMT3b之间存在靶向调节关系，阐明Hcy通过miR-125b靶向调节DNMT3b进而调节p53甲基化导致VSMCs增殖的机制。
　　方法：以原代培养的人脐静脉平滑肌细胞为实验材料，分为空白对照组、Hcy干预组(50、100、200、500μM)、叶酸拮抗组(Hcy l00μM+叶酸30μM)总计6组；巢式降落式甲基化特异性 PCR法(ntMS-PCR)检测各组细胞 p53基因启动子区DNA甲基化改变；转染DNMT3b RNAi表达质粒进入VSMCs，分析p53甲基化变化；生物信息学分析miR-125b与DNMT3b之间的靶向关系；qRT-PCR法检测各组VSMCs中miR-125b的表达，并构建携载DNMT3b mRNA3’非编码区的pGL3重组萤光素酶报告基因质粒(pGL3-DNMT3b)，利用miR-125b的过表达载体(pEZX-miR-125b)和抑制物(miR-125b inhibitor)，转染VSMCs，双荧光素酶报告基因检测系统分析荧光素酶活性，并利用qRT-PCR和Western blot测定DNMT3b基因mRNA及蛋白水平；pEZX-miR-125b及miR-125b inhibitor转染VSMCs后，MTT法检测细胞增殖活性。
　　结果：1. ntMS-PCR测p53基因启动子区DNA甲基化改变，结果显示Hcy可以使p53基因发生高甲基化改变，但并不是剂量依赖关系，在100μM Hcy处作用最明显，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；以DNMT3b RNAi表达质粒转染VSMCs，下调DNMT3b的表达，之后检测p53启动子区甲基化变化，结果显示p53甲基化程度下降，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。
　　2.生物信息学分析结果显示，在DNMT3b mRNA1000-1006bp处发现一个miR-125b的7nt的作用位点；分析其二级结构自由能，结果为-26.7 kcal/mol。
　　3. qRT-PCR法检测各组VSMCs中miR-125b的表达结果显示，Hcy干预各组miR-125b表达下调，但并不是剂量依赖关系，在100μM Hcy处作用最明显，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；以Hcy拮抗剂叶酸干预后，miR-125b表达较100μM组有升高趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　4.利用miR-125b的过表达载体(pEZX-miR-125b)和抑制物(miR-125b inhibitor)分别与pGL3-DNMT3b共转染VSMCs，双荧光素酶报告基因检测系统分析荧光素酶活性，结果显示与空质粒组相比，pEZX-miR-125b可以显著抑制荧光素酶活性(P<0.01)，加入Hcy之后，荧光素酶活性更强(P<0.01)；而miR-125b inhibitor的加入得到与之相反的结果(P<0.01，P<0.05)。
　　5.利用pEZX-miR-125b和miR-125b inhibitor转染VSMCs，qRT-PCR和Western测定DNMT3b基因mRNA及蛋白水平；结果显示，与空质粒对照组相比，pEZX-miR-125b转染组可以明显下调DNMT3b基因mRNA及蛋白水平(P<0.01)，加入Hcy之后，这种抑制作用被减弱（表达上调）(P<0.05)；而miR-125b inhibitor转染组得到与之相反的结果(P<0.01，P<0.05)。
　　6. pEZX-miR-125b及miR-125b inhibitor转染VSMCs后，MTT法检测细胞增殖活性，结果显示与对照组相比，pEZX-miR-125b组可以明显抑制VSMCs增殖，差异有统计学意义(P<0.01)，加入Hcy之后，这种抑制作用被减弱；而在miR-125b inhib itor组却得到相反的结果(P<0.01)。
　　结论：1. Hcy通过上调DNMT3b导致p53启动子区高甲基化，进而下调p53表达变化，这可能是Hcy导致VSMCs增殖的重要机制之一。
　　2. Hcy下调了VSMCs中miR-125b的表达，而且miR-125b能够通过靶向调节DNMT3b基因的表达，并可能藉此参与Hcy刺激VSMCs增殖的生物学过程。
　　3.叶酸在上述Hcy引起VSMCs增殖过程中起到一定的拮抗作用。

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前言

材料与方法

1．实验仪器和材料

2.实验方法

3. 统计学处理

结果

1. 原代人脐静脉平滑肌细胞培养与鉴定

2.Hcy对p53甲基化程度变化的影响

3.DNMT3b RNAi片段筛选

4. DNMT3b RNAi 后p53甲基化变化

5. miR-125b与DNMT3b生物信息学分析

6. Hcy对miR-125b表达的影响

7.融合DNMT3BmRNA 3’非编码区的报告基因载体的构建

8. 荧光素酶活性测定

9. miR-125b对DNMT3b表达的影响

讨论

结论

参考文献

二、综 述

1. microRNA 简述

2．miRNA 的产生及作用机制

3. miRNAs与动脉粥样硬化

4．miRNAs 与心血管事件

5.展望

综述参考文献

三、致 谢

四、攻读学位期间发表的学术论文

五、个人简历