miR-125b靶向调控野生型p53在年龄相关性白内障发病中的机制研究

摘要

随着社会经济发展、医疗进步和教育水平明显提高，世界人口老龄化问题日趋严重。WHO资料预计，到2025年全世界60岁以上老龄人口总数将超过12亿。白内障作为一种常见的衰老相关疾病，发病率迅速上升，流行病学调查发现60岁以上老人中，96％可以发现晶状体有不同程度或不同形式的混浊[1]。据专家预测，到2025年全世界将有4000万人因白内障而失明，白内障严重损害患者视力，严重影响患者生活质量，必将造成卫生资源和社会经济的沉重负担。因此，白内障已成为世界人口老龄化所面临的最严峻问题之一。
　　目前手术仍然是治疗白内障最有效的方法，但我国存在白内障患者数量庞大、患者对手术存在一定的恐惧心理、眼科医疗资源分布不均匀，以及白内障手术后调节能力重建、后发性白内障等问题。更严峻的是，白内障手术治疗的巨大医疗支出问题。因此，揭示白内障发病的关键环节，探索一种经济有效且容易推广的非手术防治新途径，是应对我国人口老龄化的重要举措，不仅具有重要的学术意义，而且具有潜在的应用前景和广泛的社会效益。
　　一直以来，白内障发病机制不明确已成为其非手术治疗研究的瓶颈，以往有关白内障发病机制的研究，唯一达成共识的是晶状体上皮细胞凋亡是非先天性白内障形成的共同细胞学基础[2]，但具体机制尚不明确。近年来有关microRNA的研究为我们开拓了新思路。
　　微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一组全长大约21-25个核苷酸的单链小分子RNA，存在于植物和动物体的细胞中[3]。microRNA主要是通过与mRNA的3'非翻译区序列完全或不完全互补配对，引起靶mRNA的降解或翻译的抑制[4]。据估计，在人类整个基因组中，有1/3的基因被microRNA调节[5]，目前已发现有大约一千种microRNA在人类基因组中表达。
　　microRNA与多种疾病包括眼部疾病的发生与发展密切相关[6-8]。在慢性丙型肝炎、肝癌、血脂异常等疾病中，microRNA在治疗领域的研究已取得突破性进展，并相继在nature，science，cell等期刊中发表文献报道[9-11]。最新研究证明microRNA在白内障的发生过程中发挥重要作用[12,13]。Hughe[12]等研究发现miR-184的seedregion突变可以导致前极性白内障，Peng[13]等研究发现let-7b与年龄相关性白内障的严重程度和发病年龄有显著关系等。
　　miR-125，是一种从线虫到人类不同物种中高度保守的microRNA，被报道作为抑制物或促进物，与各种类型的癌症和其他疾病密切相关[14]。miR-125在细胞分化、增殖、凋亡等许多不同的细胞过程中发挥关键作用，这些作用是通过靶向调控不同的转录因子[15]、基质金属蛋白酶[16,17]、生长因子[18]以及其他可能导致异常增殖、侵袭和转移、甚至癌症的变异。此外, miR-125还在宿主的免疫防御，特别是细菌或病毒感染时的应答过程中发挥重要作用[14]。
　　然而，目前国内外microRNA在眼科领域的研究才刚刚起步，且多限于表达检测，对microRNA靶基因的预测及功能验证研究甚少。其中，miR-125b在眼部疾病，特别是包括白内障在内的晶状体疾病中的研究，目前国内外尚未见明确报道。本研究第一次发现了miR-125b在年龄相关性白内障中的重要作用，并进一步探索了miR-125b通过调控靶基因野生型p53从而影响人晶状体上皮细胞凋亡的作用机制。
　　材料与方法:
　　一、组织标本
　　收集年龄相关性白内障（排除其他眼部疾病）晶状体前囊膜的新鲜组织，标本来源于中国医科大学附属第四医院眼科2012年9月至2013年6月期间行超声乳化白内障吸出术时收集撕囊的晶状体前囊膜，患者签署知情同意书。收集正常人晶状体前囊膜标本，标本来源于中国医科大学附属第四医院眼科眼库提供意外死亡的新鲜人眼透明晶状体组织。组织标本收集均通过伦理委员会批准，并根据赫尔辛基宣言的原则进行。
　　二、紫外线照射
　　利用紫外灯XX-15B（Spectroline，Westbury, NY, USA）进行照射，紫外线光谱在280-320nm之间，峰值为312 nm。利用UVX-31传感器(both UVP Inc.，SanGabriel，CA，USA)测量紫外线辐射强度和剂量(校准波长312nm)。
　　三、实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
　　按照操作说明利用Trizol试剂提取新鲜组织和细胞系中的总RNA(Invitrogen，NY, USA)。RNA的质量利用紫外可见分光光度计(UV-1800)检测。RNA的完整性利用1.5％琼脂糖凝胶电泳验证。所有样品OD260/OD280在1.8和2.0之间。
　　按照操作说明利用RT引物和TaqMan探针(Ribobio，Guangzhou，China)在ABI7500(Applied Biosystems，USA)中运行检测miR-125b的表达，RNU6B作为内参对照。利用PrimerScript RT reagent kit(Takara，Dalian，China)合成cDNA，按照操作说明利用染料法在ABI7500(Applied Biosystems，USA)中运行检测p53的表达，β-actin作为内参对照。循环结束后作出溶解曲线保证产物的特异性，经3次独立实验得到的数据利用公式RQ=2-△△Ct的方法进行分析。
　　四、细胞培养和转染
　　人晶状体上皮细胞系(SRA01/04)由辽宁省晶状体学重点实验室提供。SRA01/04细胞利用DMEM培养基（Gibco(@) Invitrogen，Carlsbad, USA），含有10％新生牛血清，100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，在37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养。
　　按照操作说明利用Lipofectamine2000(Invitrogen，USA)作为转染试剂，向细胞转染miR-125b mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control(RiboBio,Guangzhou，China)，向细胞转染p53 siRNA和阴性对照（GenePharma，Shanghai，China)。48小时后，利用RT-qPCR方法检测miR-125b的表达，利用RT-qPCR和Western blot方法检测p53的表达，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　五、流式细胞仪检测细胞凋亡率
　　利用Annexin V-EGFP凋亡试剂盒(KenGEN,China)处理实验组和对照组细胞，避光室温孵育15分钟后，利用流式细胞仪(BD Biosciences，CA，USA)检测细胞凋亡率。每个处理进行3次独立实验。
　　六、Western blot检测
　　按照操作说明利用SDS-PAGE电泳以及PVDF转印技术分离不同分子量的蛋白。常规电泳、转膜、封闭，一抗4℃过夜孵育，二抗室温孵育2h，GAPDH作为内参对照。Western Lightning(⑩)-ECL，Enhanced Chemiluminescence Substrate(PerkinElmer，NEL100001EA)检测，显影。UVP图像处理系统采集图像，ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析(National institutes of Health, Md, USA)。每个处理进行3次独立实验。
　　七、报告基因构建及检测
　　以cDNA文库为模板，扩增得到含有miR-125b预测靶位点的p53-3'-UTR序列，连接到pmiR-RB-REPORTTM载体（Ribobio，Guangzhou，China）中构建pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR。利用基因定点突变试剂盒构建含有突变靶位点的荧光报告质粒pmiR-RB-REPORTTM-mut-p53-3'-UTR。按照操作说明利用Lipofectamine2000(Invitrogen，USA)作为转染试剂，向SRA01/04细胞共转染pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR/pmiR-RB-REPORTTM-mut-p53-3'-UTR与miR-125b mimic/mimic control。48小时后，利用Dual-Luciferase报告基因检测系统(Promega，Madison，WI，USA)检测荧光素酶活性。Renilla荧光素酶质粒作为内参对照，每个处理进行3次独立实验。
　　八、统计学分析
　　应用SPSS16.0统计分析软件进行统计学分析。数据以均值±标准差表示，采用独立t检验(independent samples T-test)进行分析。p＜0.05为有统计学意义。
　　实验结果:
　　一、miR-125b与野生型p53在年龄相关性白内障晶状体组织中的表达
　　利用RT-qPCR和Western blot方法检测miR-125b和野生型p53在年龄相关性白内障晶状体前囊膜的新鲜样品与正常人晶状体前囊膜标本中的表达情况。与对照组相比，年龄相关性白内障晶状体前囊膜组miR-125b的表达显著降低(p＜0.001)，野生型p53的表达显著升高(p＜0.001)。结果表明，在组织样本中miR-125b与野生型p53的表达呈反向趋势。考虑到microRNA通过与靶基因mRNA互补结合从而抑制靶基因表达的作用方式，p53可能为miR-125b的靶基因。
　　二、miR-125b在人晶状体上皮细胞凋亡模型中的表达
　　利用RT-qPCR方法检测miR-125b在人晶状体上皮细胞凋亡模型与正常人晶状体上皮细胞系（SRA01/04）中的表达情况。与对照组相比，人晶状体上皮细胞凋亡模型组miR-125b的表达显著降低(p＜0.001)。
　　三、转染效率评定
　　为保证细胞学实验的效果，我们分别向SRA01/04细胞中转染miR-125b mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control进行转染效率的评定。转染后48小时收集细胞，利用RT-qPCR方法检测各组miR-125b的含量。转染miR-125b mimic组miR-125b的表达显著高于对照组(p＜0.001)，而转染miR-125b inhibitor组miR-125b的表达显著低于对照组(p＜0.001)，证明转染有效可以进行后续细胞实验。
　　四、miR-125b对人晶状体上皮细胞凋亡的影响
　　前述结果中，miR-125b在年龄相关性白内障晶状体组织和人晶状体上皮细胞凋亡模型中表达显著降低，提示miR-125b可能与细胞凋亡密切相关。我们在人晶状体上皮细胞凋亡模型中调节miR-125b的表达，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的改变。转染miR-125b mimic组细胞凋亡率显著低于对照组(p＜0.001)，而转染miR-125b inhibitor组细胞凋亡率显著高于对照组(p＜0.001)。
　　五、miR-125b靶基因的预测
　　为探讨miR-125b潜在的靶基因，使用3种靶基因预测软件TargetScan5.2，Diana-micro T和miRanda预测靶基因。在众多预测的靶基因中，被3种预测软件同时预测到与miR-125b有3个潜在结合位点的野生型P53，在DNA损伤调控细胞增殖和凋亡方面发挥重要作用，因此我们推测miR-125b可能通过调控野生型p53进而影响细胞凋亡。
　　六、miR-125b调控靶基因p53
　　为证实p53是否为miR-125b的靶基因，我们向人晶状体上皮细胞凋亡模型转染miR-125b mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control，转染后48小时，利用RT-qPCR方法检测p53 mRNA水平的表达情况，利用Western blot方法检测p53蛋白水平的表达情况。在转染miR-125b mimic组，p53的表达在mRNA水平和蛋白水平均显著降低(p＜0.001)，而转染miR-125b inhibitor组，p53的表达在mRNA水平和蛋白水平均显著升高(p＜0.001)。
　　为进一步证实p53是否为miR-125b直接调控的下游靶基因，我们利用Dual-Luciferase报告基因检测系统验证miR-125b是否通过p53的3'UTR的靶位点对其表达进行负向调控。向 SRA01/04细胞共转染pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR和miR-125b mimic，mimic control，共转染pmiR-RB-REPORTTM-mut-p53-3'-UTR和miR-125b mimic，mimic control。转染后48小时，检测荧光素酶活性。结果显示，与对照组相比，共转染pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR和miR-125b mimic组荧光素酶活性显著降低(p＜0.001)，而共转染pmiR-RB-REPORTM-mut-p53-3'-UTR和miR-125b mimic组荧光素酶活性无统计学差异(p＞0.05)。结果表明，miR-125b通过预测的3'UTR的结合位点与p53直接结合。
　　七、miR-125b通过抑制靶基因p53调控人晶状体上皮细胞凋亡
　　miR-125b抑制人晶状体上皮细胞凋亡，抑制p53的表达。为证实miR-125b是否通过抑制p53表达抑制人晶状体上皮细胞凋亡，我们利用siRNA在SRA01/04细胞中干扰了p53的表达。Western blot验证干扰效率(p＜0.001)。结果显示共转染miR-125b inhibitor与p53 siRNA组miR-125b对细胞凋亡的影响被阻断，表明miR-125b通过直接抑制靶基因p53的表达对人晶状体上皮细胞凋亡进行调控。
　　结论:
　　1.miR-125b在年龄相关性白内障晶状体组织中低表达。
　　2.人晶状体上皮细胞中miR-125b表达升高时，细胞凋亡减少;而细胞中miR-125b表达降低时，细胞凋亡增加。
　　3.野生型p53是miR-125b的直接靶基因，miR-125b抑制p53的表达，miR-125b与p53的表达呈反向趋势。
　　4.miR-125b通过直接抑制靶基因p53的表达调控人晶状体上皮细胞凋亡。5.miR-125b在年龄相关性白内障的发病过程中发挥重要作用，可能成为白内障诊断和治疗中一种新的生物学标记或药物新靶点。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 miR-125b在年龄相关性白内障晶状体组织的异常表达

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 miR-125b在人晶状体上皮细胞中的功能研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 miR-125b在人晶状体上皮细胞中靶基因的确定及功能研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究的创新性自我评价

参考文献

综述 微小RNA眼科研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介