浊点萃取-高效液相色谱法检测牛奶中的喹诺酮类抗生素

摘要

我国国民经济近些年来飞速发展，畜牧业也呈现出良好的发展势头，但与此同时动物性食品中兽药残留超标的现象日益突出，对人类健康和环境安全构成威胁，也影响国家对外经济贸易。近几年各国政府相继建立并不断完善动物性食品的兽药残留监测体系，限量标准日趋严格，这无疑对动物性食品中的兽药多残留分析方法提出了高效、经济、快速、准确的要求。
　　喹诺酮类药物是畜牧业中应用广泛的抗微生物药剂，在动物源食品中的过量或不当使用会导致诱导耐药菌株的产生，造成食用者肠道菌群失衡，带来潜在“三致”（致癌、致畸、致突变）作用，从而威胁人类健康。目前喹诺酮类兽药残留检测方法多有报道，但通常前处理技术操作复杂、使用有机溶剂量大，对环境造成一定负担。浊点萃取技术作为一种经济、环保的新兴样品前处理方法，与传统的溶剂萃取方法相比具有有机溶剂消耗量少、萃取效率高、操作简单的优点，能适应现代分析化学的发展要求。本文研究并确立了对牛奶中的喹诺酮类抗生素进行萃取、富集并进行高效液相色谱分析的条件，建立了浊点萃取-高效液相色谱法检测牛奶中喹诺酮类抗生素的理想方法。
　　主要研究结果如下:
　　(1)建立了浊点萃取技术对牛奶中喹诺酮类目标物进行富集分离的方法，包括破乳方式和浊点萃取方法。确定了冰乙酸的用量为0.15 mL及无水硫酸钠添加量为0.95g，离心参数为5℃、10000 r/min条件下离心10 min的最佳破乳条件;以80 g/LTween20水溶液为萃取剂，浓氨水的体积为60μL，正丁醇、无水硫酸钠的添加量为0.2 mL和0.25 g，平衡温度和时间为50℃和30 min的浊点萃取条件。利用此技术在0.05、0.1、0.2 mg/L三个水平上对供试牛奶进行添加回收率实验，实验结果表明:6种喹诺酮类药物在优化条件下的添加回收率在71.3％～96.8％之间，相对标准偏差在1.24％～6.02％之间，实验结果准确，精密度高，符合药物残留检测的要求。
　　(2)将目标物进行高效液相色谱-紫外检测器分析，确定了色谱条件:以0.1％的甲酸水溶液(A)和乙腈(B)为流动相，流速1 mL/min，选用反相色谱柱InertsilODS-3(4.6 mm×150 mm，5μm)，柱温35℃，在紫外检测器下采用二元高压梯度洗脱:(B)起始量为12％，20 min内升为18％，20.01 min突变为28％并在37 min时升至40％;紫外检测波长在前20 min为280 nm，20.01 min突变为250 nm并保持。在此条件下样品中目标物分离良好，无杂峰干扰;各药物标准品在0.05～2μg/mL范围内线性关系良好，LOD值为8.27～18.01μg/L。
　　浊点萃取结合高效液相色谱法检测牛奶中的喹诺酮类抗生素具有操作简单，实用性强，环境友好，并可以用于大批量的分析的特点，能够满足兽药残留分析的要求。

目录

声明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 研究背景

1．1．1 兽药应用与兽药残留现状分析

1．1．2 喹诺酮类药物的概述

1．2 样品前处理技术

1．2．1 固相萃取技术

1．2．2 固相微萃取技术

1．2．3 基质固相分散技术

1．2．4 加速溶剂提取

1．2．5 超临界流体提取

1．2．6 QuEChERS法

1．2．7 浊点萃取技术

1．3 喹诺酮类药物的残留检测技术

1．3．1 微生物法

1．3．2 高效液相色谱法(HPLC)

1．3．3 液相色谱-质谱联用法(LC-MS)

1．3．4 毛细管电泳法(CE)

1．3．5 免疫分析法(ELISA)

1．3．6 紫外分析法

1．3．7 化学发光分析法

1．4 本课题的研究内容及研究意义

1．4．1 本课题研究内容

1．4．2 本课题研究意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 化学试剂

2．1．2 仪器设备

2．1．3 样品原料

2．1．4 抗生素标准品

2．2 实验方法

2．2．1 喹诺酮标准溶液的配制

2．2．2 样品前处理步骤

2．3 HPLC仪器条件

2．4 方法的定性、定量

3 结果与分析

3．1 HPLC条件的优化

3．1．1 检测波长的选择

3．1．2 流动相的选择

3．2 破乳条件的优化

3．3 浊点萃取条件优化

3．3．1 表面活性剂种类的选择

3．3．2 表面活性剂浓度对目标物回收率的影响

3．3．3 浓氨水体积对目标物回收率的影响

3．3．4 电解质添加量对目标物回收率的影响

3．3．5 正丁醇添加量对目标物回收率的影响

3．3．6 平衡温度对目标物回收率的影响

3．3．7 平衡时间对目标物回收率的影响

3．3．8 超声时间对目标物回收率的影响

3．4 方法评价

3．4．1 标准曲线及线性范围和检出限

3．4．2 方法的灵敏度

3．4．3 方法的准确度与精密度

3．5 实际样品的测定

4 讨论

4．1 目标物在CPE中的富集分离本质及主要影响因素

4．2 表面活性剂紫外吸收干扰的消除

4．3 浊点萃取技术与其他前处理方法的比较

5 结论

6 创新点和进一步研究方向

6．1 创新点

6．2 进一步研究方向

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况