一种辣椒疫霉菌新型ThDP-依赖型酶的结构和酶活性研究

摘要

辣椒疫病是一种具有广泛侵染性的世界性病害，对农作物生产造成了巨大的经济损失。引起辣椒疫病的病原辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）寄主广泛，可以侵染辣椒、番茄、茄子、黄瓜等多种作物；分布广泛，在世界各地及我国多个省市均有发现；致病性强，严重影响了农作物的产量和品质。而目前主要的防治手段仍然是化学防治，由于可用药剂单一，病原菌抗药性强，使得辣椒疫病的防治愈加困难。辣椒疫霉在进化系统中有别于其它真菌，而与藻类植物的亲缘关系更近，因此在代谢调控中具有物种特异性，选取特异性的具有重要代谢调控作用的基因，筛选新型药物靶标，设计高效低毒药物，为辣椒疫病的防治开发新途径。硫胺素焦磷酸（ThDP）是维生素B1的辅酶形式，参与多种化合物的合成代谢和分解代谢。典型的ThDP-依赖型酶如乙酰羟酸合成酶（AHAs）可以催化丙酮酸和2-丁酮酸合成支链氨基酸亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，由于支链氨基酸合成路径只在高等植物、细菌和真菌中存在，人和动物体内不存在此路径，因此AHAs作为一种高效安全的除草剂作用靶标。本文中描述的PcUE1是第一个在卵菌中发现的ThDP-依赖型酶，虽然序列和二级结构信息表明 PcUE1与NAD(P)+依赖型醛脱氢酶相似，但在活性中心构象，辅酶种类和结合方式上不同，且在该基因系统进化中具有明显特异性。我们利用X射线衍射解析其三维结构，结合生物化学分析对PcUE1的作用机制进行了初步研究，结果如下：
　　（1）从辣椒疫霉基因组中成功克隆到了PcUE1基因，其氨基酸序列与NCBI数据库中NAD（P）+-依赖型醛脱氢酶只有<27％的序列相似性，且存在一段22个氨基酸的插入序列，N端具有NAD(P)+保守结合域。系统进化分析表明PcUE1与其它物种醛脱氢酶存在明显分化，且仅在疫霉属真菌中保持了>86%的同源性。
　　（2）PcUE1蛋白质表达、纯化、晶体培养及三维结构解析。经原核表达，亲和层析、离子交换层析、凝胶层析多步纯化，气相扩散法晶体培养，X-射线衍射数据收集获得PcUE1的2.2?数据，并通过分子置换法成功解析其精确三维结构。结构数据显示PcUE1由两个单体构成反向对称的同源二聚体，二聚体总的包埋面积约为4935?2。单体结构中六个平行的β-折叠两侧对称分布着三个α-螺旋，形成“罗斯曼折叠”结构，两个罗斯曼折叠相互靠近，形成～1780?2的接触面积，使两个单体形成稳定的二聚体。两个单体六个平行的β-strand结构构成的平面相互垂直，呈“L”型，形成二聚体的结构中心。
　　（3）PcUE1的结构特异性分析。PcUE1虽然在二级结构排布和整体构象上与醛脱氢酶相似，但两者活性中心明显不同。醛类脱氢酶每个单体结合一个结构Zn2+和一个催化Zn2+，其中催化Zn2+是底物结合和催化部位。而PcUE1每个单体结合一个ThDP分子和一个结构Zn2+。与ThDP-依赖型酶相似，PcUE1的ThDP结合域分为PRY结合区和PP结合区。此外，PcUE1脱辅基作用后质谱验证，发现PcUE1同时与NAD+结合，这与ThDP-依赖型酶FAD+的结合机制一致。
　　（4）确定丙酮酸为PcUE1的催化底物之一，液相色谱试验证明酶催化反应体系中丙酮酸被完全分解，证明PcUE1参与丙酮酸代谢。我们以乙酰磷酸为丙酮酸的底物类似物与PcUE1进行共结晶，获得复合物晶体。

目录

声明

英文缩略词及中文对照表

1前 言

1.1辣椒疫霉研究概述

1.2 ThDP-依赖型酶生物学研究

1.3蛋白质X衍射晶体学

研究目的和意义

2材料和方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 PcUE1生物信息学分析

3.2 PcUE1基因克隆

3.3 PcUE1的表达与纯化

3.4 PcUE1蛋白晶体生长和优化

3.5 重组蛋白晶体X射线衍射与数据收集

3.6 PcUE1结构解析

3.7 PcUE1的整体结构

3.8 PcUE1的底物筛选和鉴定

3.9 PcUE1突变体构建

4 讨论

4.1 PcUE1的序列分析

4.2 PcUE1的表达、纯化和晶体培养

4.3 PcUE1的三维结构分析和特异性

4.4 PcUE1催化特性

附录

参考文献

致谢