基于miRNA和siRNA策略抗水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的研究

摘要

水稻是我国重要的粮食作物之一，种植面积约占粮食播种总面积的30％，产量接近粮食总产量的44%。稻米品质好，价值高，是我国主要的商品粮食，亦是发酵工业的重要原料。水稻病害是限制水稻进一步提高产量和品质的主要瓶颈之一。水稻条纹叶枯病（Rice stirp disease）和水稻黑条矮缩病（Rice black-streaked dwarf disease）是在水稻生产中普遍发生的、危害严重的病毒病害。发病严重时，感病植株死亡，最终导致水稻产量明显降低，甚至绝产；即使存活到成熟，也表现为生长严重受阻，对水稻生产造成严重损失；并且两种病毒病均是由灰飞虱持久性传播的，在田间，这两种病害可以同时发生，加重发病症状，对水稻生产造成更加严重的危害。
　　RNA沉默（RNA silencing）是一种广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核生物中，由双链RNA（double strand RNA，dsRNA）引发的，通过序列特异性的相互作用来抑制基因表达的现象，被认为是真核生物阻止病毒、转座子等外来核酸的入侵，维持生物基因组稳定性的重要防御机制。其中，小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是沉默RNA的最主要组成部分。利用RNA干扰技术培育抗病毒的转基因植物是目前常用的一种抗病毒基因工程策略，通常称为RNA介导的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance，RMVR）。其中，利用人工合成microRNA（artificial miRNA，amiRNA）的RNA介导病毒抗性策略培育抗病毒转基因植物取得了很大进展，具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特点，被认为是一种具有较大应用价值的植物抗病毒基因工程策略。此外，随着对RNA介导的病毒抗性的不断研究，利用RNAi策略防治病毒病已经不止局限于培育获得高病毒抗性的转基因植物。目前，有研究表明，给传毒昆虫介体饲喂dsRNA，可以使昆虫介体失去传毒能力。这种防控病毒病的方法主要是切断植物病毒的传播途径，不需要产生转基因植物就可以达到防治病毒的目的，更加具有生物安全性。
　　本研究以水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）为实验材料，利用嵌合人工miRNA策略，培育获得了具有较高抗病水平且能够稳定遗传的双抗RSV和RBSDV转基因水稻新材料；以灰飞虱和RSV为实验材料，利用RNA沉默技术，对可能参与昆虫介体传播病毒的相关蛋白进行了功能验证，在此基础上，利用RNAi对昆虫体内的传毒相关蛋白进行基因沉默，阻断昆虫对病毒的传播，减轻病毒对作物的危害。双抗病毒转基因水稻新材料的获得，为我们进一步将现代生物技术与传统育种技术相结合培育抗病毒水稻新品种奠定了基础；介体传毒相关蛋白的鉴定，为我们进一步高效地利用RNA沉默技术控制病毒病的危害提供重要依据。主要研究结果和结论如下：
　　（1）基于amiRNA策略培育双抗RSV和RBSDV转基因水稻新材料
　　基于amiRNA抗病毒策略，选取水稻内源的osa-MIR528作为前体，利用WMD网站设计靶向于RSV及RBSDV的CP基因及其3′-UTR区上的有效amiRNA；然后选择了分别靶向于RSV和RBSDV的CP基因中间片段、3′端、3′-UTR区域的3个amiRNA（分别命名为 amiR-RSVM，amiR-RSV3，amiR-RSVU和amiR-RBSDVM，amiR-RBSDV3，amiR-RBSDVU）。利用重叠PCR（overlap PCR）将其替换掉osa-MIR528自身的miRNA有效片段；然后嵌合连入改造好的pCAMBIA1300表达载体，获得了能同时靶向于RSV和RBSDV的3个amiRNA前体二聚体植物表达载体（pamiR-M，pamiR-3和pamiR-U）。
　　将构建好的3个植物表达载体导入农杆菌EHA105，瞬时侵染本生烟验证其有效性，3d后amiRNA的Northern分析结果表明，构建好的amiRNA植物表达载体在侵染的本生烟体内能有效地表达，产生成熟的amiRNA，并下调靶基因的表达。5′-RLM-RACE实验表明，amiRNA能精确介导靶基因序列的剪切。
　　通过农杆菌介导的基因转化方法转化临稻10愈伤组织，经除草剂PPT筛选和PCR检测，分别获得含有pamiR-M，pamiR-3和pamiR-U的T0代转基因植株为35株、37株、48株；转基因植株内，各类改造后的pre-amiRNA均能被识别，并表达产生成熟的amiRNA。
　　T0代转基因植株经过连续自交，结合除草剂抗性检测和PCR鉴定，获得T2代植株。T2代转基因植株病毒抗性鉴定结果显示，各转基因株系都表现出了对 RSV和RBSDV的不同程度的抗性，包含pamiR-M，pamiR-3和pamiR-U的转基因株系对RSV的抗病率分别为29.52%，44.14%和54.17%；对 RBSDV的抗病率分别为26.66%，36.04%和45.83%。
　　对获得的转基因植株进行Southern和Northern杂交分析，结果表明，外源基因以不同的拷贝数整合到了水稻基因组中。在转基因植株中靶病毒 RNA的下调是由初级的amiRNA介导所诱发的，并且沉默可以通过siRNA途径向双边延长，初级的amiRNA和次级的siRNA共同介导转基因植株对病毒的抗性。遗传稳定性分析表明转基因和其介导的病毒抗性能在转基因植株中稳定遗传。
　　（2）介体传毒相关蛋白的鉴定及干扰基因的表达对介体传毒的影响
　　以已报道的灰飞虱体内与RSV互作的蛋白基因NCuP作为候选基因，设计引物，利用RT-PCR克隆得到目的基因。利用qRT-PCR技术，研究灰飞虱NCuP在介体的不同发育阶段的表达特性，发现其在灰飞虱的整个发育过程中均有表达，但不同发育时期的表达是存在差异的，1龄若虫的NCuP表达量最高，随着昆虫的生长其表达量逐渐降低。qRT-PCR检测RSV的侵染对不同龄期灰飞虱NCuP表达的影响，结果显示，带毒灰飞虱体内的NCuP的表达水平明显高于无毒灰飞虱体内的NCuP的表达水平，初步表明NCuP可能参与了RSV在介体内的繁殖传播。
　　体外合成NCuP的dsRNA，饲喂带RSV的灰飞虱，利用qRT-PCR检测靶基因及病毒基因在昆虫体内的表达情况，结果显示，饲喂dsNCuP的灰飞虱体内NCuP的表达水平和RSV的积累水平均有显著降低，推测NCuP可能参与了RSV在介体内的繁殖。对饲喂dsNCuP的灰飞虱进行获毒率和传毒率的检测发现，对照组的获毒率和传毒率分别为41.44%和68.33%，而饲喂 dsNCuP的灰飞虱的获毒率和传毒率分别为28.89%和23.89%。表明，干扰灰飞虱体内的NCuP的表达可以显著降低灰飞虱的获毒率和传毒率。

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中文摘要

英文摘要

1前言

1.1水稻条纹病毒的研究进展

1.1.1水稻条纹叶枯病

1.1.2水稻条纹病毒

1.1.3水稻条纹病毒的基因组转录及复制

1.1.4水稻条纹病毒的传毒介体及传毒机制

1.2水稻黑条矮缩病毒的研究进展

1.2.1水稻黑条矮缩病

1.2.2水稻黑条矮缩病毒

1.2.3水稻黑条矮缩病毒的基因组转录及复制

1.2.4水稻黑条矮缩病毒的传毒介体及传毒机制

1.3水稻病毒病的防治

1.3.1通过化学防治来控制病害

1.3.2运用品种抗性来控制病害

1.3.3基因工程技术来控制病害

1.4 RNA沉默

1.4.1小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）

1.4.2微小RNA（microRNA，miRNA）

1.5 RNA沉默与植物病毒抗性

1.6本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1毒源

2.1.2供试植物、昆虫

2.1.3菌株和质粒

2.1.4序列测定

2.1.5常用化学试剂与分子生物学试剂

2.1.6引物设计

2.2方法

2.2.1 osa-miR528的克隆

2.2.2 amiRNA的筛选

2.2.3 amiRNA植物表达载体的构建

2.2.4农杆菌介导的瞬时表达

2.2.5 Northern杂交分析

2.2.6植株siRNA/miRNA的Northern blot分析

2.2.7 5'-RLM-RACE验证miRNA靶基因的剪切位点

2.2.8农杆菌介导的水稻转化及转基因植株的获得

2.2.9转基因水稻植株的抗病性鉴定

2.2.10转基因植株的ELISA检测

2.2.11转基因植株的Southern blot分析

2.2.12转基因植株的遗传稳定性分析

2.2.13 amiRNA二级结构的预测

2.2.14灰飞虱NCuP基因的克隆

2.2.15 qRT-PCR检测灰飞虱体内目的基因的表达量

2.2.16灰飞虱的饲毒实验

2.2.17检测灰飞虱的带毒率

2.2.18体外转录合成NCuP的dsRNA

2.2.19 dsRNA饲喂灰飞虱

2.2.20灰飞虱的获毒试验

2.2.21灰飞虱的传毒试验

3结果与分析

3.1基于amiRNA策略培育双抗RSV和RBSDV转基因水稻新材料

3.1.1水稻osa-miR528的扩增

3.1.2 amiRNA的筛选及引物设计

3.1.3 pre-miRNA的改造

3.1.4农杆菌介导的瞬时侵染检测amiRNA表达载体的有效性

3.1.5 Northern blot检测靶RNA的积累

3.1.6 5'-RLM-RACE验证miRNA靶基因的剪切位点

3.1.7 T0代转基因植株的获得及检测

3.1.8转基因植株的amiRNA的表达检测

3.1.9 T2代转基因植株的抗性鉴定

3.1.10 T2代转基因植株的Northern杂交分析

3.1.11 T2代转基因植株的amiRNA杂交分析

3.1.12 T2代转基因植株的siRNA杂交分析

3.1.13转基因植株的Southern blot分析

3.1.14转基因和病毒抗性的遗传稳定性分析

3.1.15 amiRNA二级结构的预测

3.2介体传毒相关蛋白的鉴定及沉默传毒相关蛋白对介体传毒的影响

3.2.1灰飞虱NCuP基因的克隆

3.2.2 NCuP基因在灰飞虱不同发育时期的表达特性

3.2.3 RSV的侵染对不同龄期灰飞虱NCuP基因表达的影响

3.2.4体外转录合成dsNCuP

3.2.5 dsNCuP干扰灰飞虱体内的RSV表达

3.2.6饲喂dsNCuP对灰飞虱获毒效率的影响

3.2.7饲喂dsNCuP对灰飞虱传毒效率的影响

4讨论

4.1靶向于RSV和RBSDV CP基因不同区段的amiRNA介导了对两种病毒的抗病性

4.2沉默灰飞虱体内与RSV互作的基因影响灰飞虱对RSV的传播

5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文及成果