山东地区猪流行性腹泻病毒感染情况调查及其单克隆抗体制备

摘要

自2010年10月起，猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）在中国严重爆发流行，之后，美国、墨西哥、加拿大、韩国、中国台湾等地也先后爆发不同程度的仔猪腹泻，对全球养猪业造成了严重的经济损失。本研究针对猪流行性腹泻主要开展了以下三个方面的工作：
　　1.山东地区猪流行性腹泻感染情况调查
　　为了分析猪流行腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）在山东地区的流行和遗传变异情况，对2013-2015年收集的510份临床腹泻样品，参照GenBank中已经发表的PEDV毒株的N基因序列，设计1对特异性引物，利用RT-PCR技术检测PEDV抗原，并对其中的16份阳性样品进行病毒分离与S1基因测序分析。临床检测结果表明：PEDV临床检出率由2013年的57.8％提高到2015年的77.94%，PEDV在山东地区的发病季节除春冬季节，夏季也呈高发趋势，且各地区均有不同程度的感染。S1基因序列分析结果表明，16株PEDV分离毒株间的S1基因的核苷酸序列同源性为91%~99.8%，氨基酸序列同源性为87.8%~99.7%；山东分离毒株与15个国内外参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为90.5%~100%和88.4~99.9%。对S基因分子流行病学分析发现，20个国外参考毒株、25个国内参考毒株与本次分离到的16个PEDV毒株被分为两个不同的进化分支G1和G2。在2013-2015年分离到的16株毒株中，有3株位于G1中，距离CV777经典毒株较近；其他的13株位于G2中，以近年流行毒株为主，而山东分离株主要在G2分支中，这也解释了现有CV777疫苗毒株在山东地区的免疫保护力不佳的原因。本研究结果从分子流行病学角度分析了山东地区PEDV的流行和变异情况，为指导该地区PEDV防控提供了参考依据。
　　2. PEDV单克隆抗体的制备及鉴定
　　本研究将猪流行性腹泻病毒变异株S蛋白上的一个抗原表位区（83~276aa）和N蛋白上的一个抗原表位区（126~328aa）分别扩增并连接到原核表达载体pET28a上，将构建好的重组质粒pET28a-MtS和pET28a-N分别转化到宿主表达菌BL21，经IPTG诱导，获得以可溶性形式表达的S蛋白片段和以包涵体形式表达的N蛋白片段。将两种重组蛋白片段纯化后，分别免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞融合技术，筛选获得两株能稳定分泌针对PEDV S蛋白抗原表位的杂交瘤细胞（分别命名为1E5和5B7）和三株能稳定分泌针对PEDV N蛋白抗原表位的杂交瘤细胞（分别命名为2E1、2B3和2B5）。
　　针对S蛋白的两株杂交瘤细胞1E5和5B7细胞上清效价分别为1:125、1:100，诱导小鼠产生的腹水ELISA抗体效价分别为1:12500和1:10000，单抗亚类鉴定均为IgG1，轻链均为κ型。Western Blot结果表明两株单抗均能识别重组MtS蛋白；间接免疫荧光试验显示，5B7与PEDV经典毒株（CV777）和变异株均有反应，而1E5只与PEDV变异株反应，不与经典毒株反应，结果表明这两株单抗所识别的S蛋白抗原位点不同。
　　针对N蛋白的三株杂交瘤细胞2E1、2B3和2B5的细胞上清效价分别为1:256、1:128和1:128，诱导小鼠产生的腹水ELISA抗体效价分别为1:12500、1:10000和1:10000，单抗亚类鉴定分别为IgG1、IgG2b、IgG2a类，轻链均为κ型。Western blot和IFA试验结果显示三株单克隆抗体均具有良好的反应性和特异性。
　　3. N蛋白间接ELISA的初步建立
　　本研究以纯化的N蛋白作为包被原，建立了检测PEDV血清抗体的间接ELISA。通过优化各项反应条件，最终将间接ELISA的反应条件确定为：N蛋白抗原最佳包被量为1.5μg/mL，最佳包被条件为4℃包被过夜；最佳封闭液为5%脱脂奶粉37℃封闭1.5h；酶标二抗的最佳反应条件为1:3000稀释37℃反应1h；被检血清最佳反应条件为1:100稀释37℃反应1.5h；底物最佳条件为室温反应15min。当待检血清OD450值≥0.2008判定为阳性，带检血清≤0.1822判定为阴性，介于两者之间为可疑。比对试验结果表明，建立的间接ELISA具有良好的特异性、重复性和符合性，可用于临床上PEDV抗体水平的监测。