小尾寒羊肠道正常菌群高通量测序分析及羊源微生态制剂的研制

摘要

动物的肠道菌群具有营养与代谢，免疫与保护，维持肠道菌群平衡，改善肠道环境，促进动物生长发育等作用，动物在一些应激（冷、热、惊吓、长途运输、细菌和病毒等）状态下，肠道菌群会发生紊乱，继而动物发生腹泻，免疫功能降低，生长指标下降等，给养殖业带来巨大的经济损失。小尾寒羊是我国优质的皮肉兼用型地方绵羊品种之一，因其具有躯体高大、性早熟、耐粗饲、生长发育快、繁殖率高、抗病力强、遗传性能稳定、适应性广等优良特性，而被广泛饲养。然而随着饲养规模的扩大，消化道类疫病多发，特别是细菌性疾病。而且目前缺少良好的治疗方法，尽管抗生素能治疗消化道类疫病，但会打破肠道菌群平衡状态，造成肠道菌群紊乱以及细菌耐药性的产生。微生态制剂作为抗生素的辅助治疗剂，有无残留、无耐药性、无毒副作用、效果显著、不污染环境等优点，其不但能防病治病、提高饲料转化率和畜禽生产性能，还可以改善动物健康状况。但是目前缺少羊专用的微生态制剂，我们对羊肠道菌群的了解也不够深入。目前对肠道菌群的研究多应用传统的分子生物学技术，如实时荧光定量 PCR和变性梯度凝胶电泳（DGGE），这些方法不仅耗时而且工作量大，且只能检测出一定丰度以上的微生物，对复杂的肠道微生物群的研究不够全面，而Illumina高通量测序技术能够测序到肠道中所有微生物DNA序列，全面分析肠道微生物群落的多样性和丰度，以满足我们对肠道微生物群落的认识。因此，本试验采用Illumina MiSeq的高通量测序技术对小尾寒羊肠道菌群的组成和多样性进行分析，并以分析的结果为依据，对小尾寒羊肠道细菌进行筛选，最后用筛选出的菌株研制成了微生态制剂，并对微生态制剂的效果进行了检验。
　　通过Illumina MiSeq的高通量测序技术对小尾寒羊空肠、盲肠和直肠样本中菌群组成、α多样性、β多样性和样本聚类等方面进行了分析研究，结果显示：在样本菌群组成方面，小尾寒羊盲肠和直肠中主要细菌为Bacteroides（拟杆菌属），Ruminococcus（瘤胃球菌属），Lactobacillus（乳杆菌属），Incertae_Sedis和Flavonifractor；空肠中主要细菌为Lactobacillus（乳杆菌属），Chloroplast，Incertae_Sedis，Acetitomaculum和Ruminococcus（瘤胃球菌属）；小尾寒羊空肠菌群组成与个体差异有关，而盲肠和直肠菌群组成相对来说比较稳定，与个体间的差异相关性不大。在样本菌群变化趋势方面，可以推测出，从小尾寒羊的十二指肠端到直肠端，乳杆菌属的丰度越来越小，拟杆菌属的丰度越来越大。在α多样性分析方面，小尾寒羊盲肠和直肠的细菌丰度和多样性都大于空肠，而盲肠和直肠间的差异性不显著。在β多样性和样本聚类分析方面，小尾寒羊盲肠和直肠中细菌群落在进化上的相似度较高，而前两者与空肠中细菌群落相似度较低。
　　依据高通量测序的分析结果，采用传统的生物学方法对小尾寒羊肠道中的细菌进行分离鉴定，并对分离的菌株进行生长性能、耐酸耐胆盐和抑制有害菌生长等方面的筛选，结果显示：筛选出3株生长速度快、对酸和胆盐耐受力强、抑菌效果好的菌，分别为M1（干酪乳杆菌）、M2（植物乳杆菌）和L1（枯草芽孢杆菌），将这3株菌发酵混合后制成微生态制剂，并通过饲喂小白鼠，检验微生态制剂的安全性，结果表明：所研制的微生态制剂是安全的。
　　将研制的微生态制剂分别按低（3mL/只/d）、中（6mL/只/d）、高剂量组（12mL/只/d）混饮给予家兔，并对家兔生长性能和免疫功能方面的相关指标进行检测，结果表明，研制的微生态制剂可以提高家兔平均日增重，降低料肉比，提高血清中兔瘟抗体水平、血清中IFN-γ和溶菌酶浓度，其中，中高剂量组效果最明显（P<0.05），且中、高剂量组间的差异不显著（P>0.05）。将研制的微生态制剂饲喂腹泻羊，并以腹泻对照组和健康对照组进行对照，经过5天的调理治疗后，腹泻试验组的羊全部恢复正常，由此证明研制的微生态制剂对腹泻羊具有很好的治疗和调理作用，可以在实际生产中进行推广应用。

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1. 引言

1.1肠道菌群研究概述

1.1.1肠道菌群的形成过程

1.1.2肠道菌群的组成与分布

1.1.3肠道微生物的类群

1.1.4肠道菌群的功能

1.2肠道菌群研究方法概述

1.2.1 传统培养方法

1.2.2以宏基因组学为基础的研究方法

1.3微生态制剂研究概述

1.3.1 微生态制剂的研究现状

1.3.2 微生态制剂的分类

1.3.3常用益生菌的种类

1.3.4 微生态制剂对反刍动物的影响

1.3.5微生态制剂在反刍动物方面的应用

1.4 本研究的目的及意义

2. 材料与方法

2.1菌（毒）株与试验动物

2.2 试剂和仪器

2.3小尾寒羊肠道正常菌群群落分布高通量测序分析

2.3.1 肠道样本的采集

2.3.2 DNA的提取

2.3.3 MetaVx? 文库构建 和 Illumina MiSeq 测序

2.3.4 生物信息学和统计分析

2.4具有益生特性的小尾寒羊肠道正常菌群的分离鉴定

2.4.1小尾寒羊肠道正常菌群的分离

2.4.2 革兰氏染色、镜检

2.4.3生化鉴定

2.4.4 16S rDNA基因序列的测定与系统发育分析

2.4.5生长曲线的测定

2.4.6耐酸试验

2.4.7耐胆盐试验

2.4.8体外抑菌试验（牛津杯法）

2.4.9药敏试验

2.4.10安全性试验

2.5微生态制剂对家兔生长性能、免疫功能的影响及对腹泻羊的调理作用

2.5.1 微生态制剂的制备

2.5.2 兔瘟组织灭活苗的制备

2.5.3 动物试验

2.5.4微生态制剂对家兔生长性能的影响

2.5.5微生态制剂对家兔免疫功能的影响

2.5.6 微生态制剂对腹泻羊的调理作用

2.5.7 数据分析

3. 结果与分析

3.1小尾寒羊肠道正常菌群群落分布的高通量测序分析

3.1.1测序数据质量分析结果

3.1.2样本菌群结构分析

3.1.3小尾寒羊肠道菌群α多样性指数分析

3.1.4小尾寒羊肠道菌群β多样性指数和样本聚类分析

3.2具有益生特性的小尾寒羊肠道正常菌群的分离鉴定

3.2.1 分离菌菌落及镜检形态观察

3.2.2分离菌生化鉴定结果

3.2.3 16S rDNA基因序列的测定与系统发育分析

3.2.4生长曲线测定结果

3.2.5耐酸试验结果

3.2.6耐胆盐试验结果

3.2.7体外抑菌试验结果

3.2.8药敏试验结果

3.2.9安全性试验结果

3.3微生态制剂对家兔生长性能、免疫功能的影响及对腹泻羊的调理作用

3.3.1微生态制剂对家兔生长性能的影响结果

3.3.2 血清抗体水平

3.3.3 血清IFN-γ浓度

3.3.4 血清溶菌酶含量

3.3.5 微生态制剂对腹泻羊调理作用的结果

4. 讨论

5. 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文

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