猪流行性腹泻病毒S1蛋白间接ELISA方法的建立与应用及卵黄抗体的制备

摘要

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED)是猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种高度接触性的消化道传染病，主要引起病猪呕吐、急性水样腹泻、脱水以及仔猪的高死亡率等症状。各个年龄阶段的猪群均可造成PED感染，传播速度快，仔猪的发病率、死亡率很高，给养猪业造成巨大的经济损失。近年来PED的流行趋势不断扩大，已经在世界范围内造成严重影响。为了更好地防治该病，本研究分离到一株PEDV病毒（PEDV-HN/01）；以截短表达的S1蛋白建立了具有良好特异性和敏感性的间接ELISA方法；制备了具有良好中和效果的卵黄抗体。本研究分为三部分：
　　1猪流行性腹泻病毒的分离和鉴定
　　本研究通过对采集的病料接种到含终浓度6ug/ml胰酶的Vero细胞上进行分离传代，盲传到4代后出现局灶性细胞病变。通过对S1基因序列分析，该毒株与经典株CV777相比发生了变异，与美国、韩国毒株关系较远，同源性分别为91.9﹪、91.8﹪。该病毒能使Vero细胞产生空泡、融合病变，对第20代病毒TCID50测定结果为10-4.3/0.1ml。将病毒的细胞培养产物应用RT-PCR、间接免疫荧光、动物回归试验进行鉴定。证明所分离到的病毒为PEDV，并将其命名为PEDV-HN/01。
　　2 PEDV S1基因截短克隆表达及间接ELISA方法的建立
　　本试验以PEDV-HN/01株PMD-18T-S1质粒为模板，设计引物，成功地克隆出S1截短基因并连接到原核表达载体PET-32a(+)中，构建了重组表达质粒PET-32a-tS1，经测序鉴定正确后，转化至感受态细胞BL21（DE3)中，并进行IPTG诱导表达。对重组的表达蛋白用镍离子亲和层析法纯化，Western-blotting检测表明：表达的S1蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性的免疫反应，表明原核表达的S1蛋白具有良好的反应原性。
　　以原核表达的重组S1蛋白作为检测抗原，优化ELISA反应条件，建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。其反应条件为：抗原最佳包被浓度为5.13μg/mL，血清样品最佳稀释度为1：100，包被时间为4℃作用12h，1.0％BSA37℃封闭1h，二抗1：4000稀释，37℃作用1h，底物液显色时间为10 min，抗体临界值为D450 nm≥0.338判为阳性，D450 nm＜0.338判为阴性，该方法特异性强，该方法仅对PEDV血清检测为阳性，对猪传染性胃肠炎、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性；其批内和批间重复性试验的变异系数为1.06%～6.81%。在敏感性试验中，当阳性血清稀释至6400倍时，虽然显色后靠肉眼观察难以判断阴、阳性结果，但酶标仪仍可以检测出为阳性。对50份疑似猪流行性腹泻血清样品进行检测，该方法与商品试剂盒的符合率为94.0％。选20份用建立的ELISA方法检测的阳性血清进行病毒中和试验，结果表明两者具有较好的相关性。采用建立的ELISA方法检测了河南、河北、安徽、山东地区临床样品，抗体阳性达到42.00%。结果表明建立的以重组S1蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于PEDV抗体检测及疫苗免疫效果评价。
　　3 PEDV卵黄抗体的制备
　　本试验利用分离到的PEDV-HN/01细胞毒种，成功制备3000ml Vero细胞病毒培养物，用超滤浓缩仪器进行浓缩、过滤。利用凝胶层析方法纯化超滤后的病毒，-80℃保存，对收集的病毒液进行SDS-PAGE分析。结果显示细胞毒里的小牛血清已被除去，表明该方法具有良好的纯化效果。将纯化后细胞毒与蜂胶佐剂按比例混合，作为免疫抗原，免疫产蛋鸡，每隔两周免疫，共免疫3次，定期利用ELISA方法检测抗体效价水平变化趋势。琼脂扩散试验抗体效价最高达到最高时，收集并纯化卵黄抗体(IgY)，SDS-PAGE结果分析纯化效果较好。将卵黄抗体与CV777疫苗毒进行中和试验，结果测得体外中和抗体的效价为PD50=10-2.1/0.1ml。结果表明本研究纯化浓缩后的病毒具有良好的免疫原性，作为免疫抗原免疫产生的卵黄抗体具有较高的抗体效价，为进一步研制猪流行性腹泻卵黄抗体生物制剂奠定了基础。