高密度脂蛋白模拟肽Reverse-D-4F改善高脂饮食诱导的小鼠内皮祖细胞损伤的研究

摘要

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是危害人类健康最严重的心脑血管疾病之一，故阻止AS的进展已成为基础医学与临床医学的热点课题。人类饮食情况已被证明在心血管疾病的发生发展中发挥了重要的作用。已有报道发现，无论在健康人群还是在心血管患者中，高脂饮食均可诱导其血管功能障碍，降低外周血内皮祖细胞（endoth elial progenitor cells，EPCs）水平，同时增加白细胞数量；最近zhang等研究发现，Apo A-I模拟肽D-4F会通过内皮一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）/一氧化氮（nitric oxide，NO）信号通路促进EPCs的增殖、迁移和粘附。近期发现ApoA-I模拟肽reverse-D-4F，按照D-4F氨基酸顺序反向排列，通过抑制血管壁内皮细胞的炎症和氧化反应，进一步降低主动脉窦AS斑块的面积及斑块巨噬细胞的数量，同时reve rse-D-4F还具有提高HDL（high density lipoprotein，HDL）功能的作用。然而reverse-D-4F对高脂饮食小鼠外周血细胞亚群的影响，和对体内和体外EPCs的保护作用尚不清楚。本研究通过观察各组小鼠外周血EPCs、淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞各亚群的数量，动脉壁炎症因子水平和祖细胞的数量，各组小鼠骨髓源EPCs功能，来研究A poA-I模拟肽reverse-D-4F对高脂饮食小鼠EPCs数量和功能的影响及其机制。
　　1.小鼠骨髓单个核细胞诱导分化为EPCs的生物学特性研究
　　比较差速贴壁方法分离的不同时间点贴壁的小鼠骨髓单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）诱导分化为EPCs的生物学特性，探讨最适宜贴壁时间。Ficoll密度梯度离心分离小鼠骨髓MNCs，接种于预先铺有纤维连接蛋白的培养板上，定义为1 d贴壁细胞组，取1d非贴壁细胞再接种为3d贴壁细胞组，继续培养2d取非贴壁细胞再接种为3 d非贴壁细胞组，继续培养20 d后，分别检测3组诱导分化EPCs亚群表面标志、粘附能力和成血管能力。结果显示，1 d贴壁细胞中CD34+、FLK-1+、CD34+/FLK-1+细胞数明显多于3 d贴壁细胞和3 d非贴壁细胞(P<0.01)；1 d贴壁细胞粘附能力、成血管能力均显著高于3d贴壁细胞和3d非贴壁细胞；1d贴壁细胞和3d贴壁细胞eNOS表达量无显著差异，但均显著高于3 d非贴壁细胞(P<0.01)；3 d贴壁细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达水平显著高于1 d贴壁细胞和3 d非贴壁细胞(P<0.01)。以上结果提示，1d贴壁小鼠骨髓MNCs诱导分化的EPCs生物学功能显著高于3d贴壁细胞和3d非贴壁细胞；3d贴壁细胞较1d贴壁细胞和3d非贴壁细胞表达较多的VEGF，1 d贴壁细胞和3 d贴壁细胞eNOS表达高于3 d非贴壁细胞。小鼠骨髓EPCs诱导分化培养最适宜贴壁时间为1~3 d。
　　2. Reverse-D-4F提高EPCs功能及其机制研究
　　载脂蛋白A-I模拟肽抑制apoE敲除小鼠AS的发展；EPCs可以修复致AS的因素诱导的受损内皮细胞。本研究探明了apoA-I模拟肽reverse-D-4F对小鼠骨髓来源晚期EPCs的增殖、迁移和体外成血管功能的影响，发现reverse-D-4F（10–100 mg/ml）提高了EPCs的增殖、迁移和体外成血管功能，激活了AKT和eNOS，并呈剂量依赖性。LY294002（PI3激酶抑制剂）和L-NAME（一氧化氮合酶抑制剂）明显抑制reverse-D-4F介导的EPCs增殖、迁移和体外成血管生物学功能的提高，并且LY294002明显抑制reverse-D-4F诱导的AKT和eNOS的激活。结果表明，reverse-D-4F部分通过PI3K/AKT/eNOS信号通路，提高EPCs增殖、迁移和体外成血管功能。
　　3. Reverse-D-4F增加高脂饮食小鼠EPCs数量和功能及其机制研究
　　尽管HDL具有改善EPCs的功能，但HDL载脂蛋白AI模拟肽reverse-D-4F对EPCs的动员和损伤修复仍有待进一步研究。本研究观察了reverse-D-4F对高脂饮食C57BL/6J小鼠外周血细胞亚群的影响和reverse-D-4F对肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）诱导EPCs功能受损的改善。发现高脂饮食显著降低了EPCs的数量、迁移和淋巴细胞在白细胞中的百分比；然而，也显著增加了外周血中白细胞数量、单核细胞和中性粒细胞占白细胞的百分比，和血浆中血管内皮生长因子（VEGF）和TNF-α的水平。reverse-D-4F明显抑制高脂饮食对外周血细胞亚群及细胞因子水平的影响，增加血浆中基质细胞衍生因子1α（stromal cell derived factor1α，SDF-1α）水平。体外研究证明，TNF-α通过抑制AKT和eNOS的活性来抑制EPCs增殖、迁移和体外成血管形成，reverse-D-4F能恢复上述TNF-α诱导的EPCs的损伤、AKT和eNOS的激活。PI3激酶（PI3K）抑制剂（LY294002）和AKT抑制剂（perifosine）明显抑制reverse D-4F对TNF-α诱导EPCs功能损伤的修复作用。我们的研究结果表明，reverse D-4F可能是通过增加外周血中SDF-1α水平，降低TNF-α水平来恢复高脂饮食小鼠EPCs的数量，并且能够部分通过PI3K/AKT信号通路修复TNF-α诱导的EPCs的功能障碍。