二穗短柄草APETALA1/FRUITFULL转录因子亚家族基因功能分析

摘要

在植物进化的历史过程中，MADS-box转录因子发生了巨大的变化，包含了各种加倍和缺失事件，这导致了陆地植物的单一物种或者整体分支发生了改变。这些转录因子在植物发育过程中扮演了重要的角色，其中大部分决定了花器官的发育。在被子植物中，基因的加倍与核心真子叶植物的分化有关系，其中一个分支包含了几乎大多数的开花植物（大约75%） ，这一分支也包含了许多重要的模式植物例如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、金鱼草（Antirrhinum majus）和西红柿（Solanum lycopersicum）等。这一加倍事件的发生影响了一些关键的花器官决定基因的族系变化，包括APETALA1（AP1；A基因功能）、APETALA3（AP3；B基因功能）和AGAMOUS（AG；C基因功能）。对于非核心真双子叶植物和核心真双子叶植物的AP3和AG同源基因的功能研究显示，这些基因在花瓣、雄蕊和心皮的产生过程中是保守的。二穗短柄草是一种新兴的温带禾本科模式作物，具有生长周期短、基因组小、生长条件简单和自花授粉等优点，并且与小麦、水稻等主要的禾本科粮食作物具有很近的同源关系，因此，对于二穗短柄草基因的功能研究有助于我们更好的理解小麦等粮食作物的基因功能。二穗短柄草AP1/FUL转录因子亚家族属于MADS-box转录因子家族，这个亚家族在植物进化过程中也发生了几次加倍事件。在本研究中，我们主要从突变体的角度对二穗短柄草的四个AP1/FUL亚家族基因的功能进行研究，主要结果如下： （1）在二穗短柄草中，主要有四个AP1/FUL亚家族基因BdVRN1、BdFUL2、BdFUL3和BdFUL4。其中BdFUL4基因在进化过程中丢失了主要的功能区域FUL motif，可能与其他的基因进化关系比较远，产生了与祖先不同的功能。 （2）BdVRN1基因的突变，能够导致植物出现极其晚花的表型，这说明BdVRN1基因在植物开花时间调控过程中具有重要作用。 （3）BdFUL2基因的突变，能够导致花器官发育出现异常：外稃发生退化，形成叶片状组织；外轮花器官的颖片和浆片发生了异常；腋生分生组织以及小穗原基的的数目有了一定的增加；小穗轴伸长，发育成枝条状组织。这些结果说明BdFUL2基因在花形态建成和花器官发育过程中具有重要作用。 （4）对WT和ful2.c1突变体种子的分析发现，ful2.c1突变体的结种量要多于WT的结种量，但是ful2.c1突变体的种子大小要明显小于WT。为了获得结种量增加，而花序发育未发生异常的植株，我们构建了BdFUL2.RNAi和TaFUL2.RNAi载体，打算分别转化二穗短柄草和小麦，希望能够得到更有利于粮食作物增加产量的表型。 （5）BdFUL2基因可能能够形成四因子模型在调控外轮花器官中起作用。它能够与E类基因互作，可能具有A类基因的功能，并且自身能够发生互作，形成同源二聚体，这符合拟南芥四因子模型AP1-AP1-SEP-SEP ，能够调控外轮花器官的发育。然而， BdFUL2基因最后能够形成正常的小花结构，这可能是由于BdFUL2基因与其他的AP1/FUL基因例如BdVRN1在功能上相互冗余，BdVRN1基因在发育后期代替了BdFUL2形成了新的四聚体调控了外轮花器官的发育。 （6）BdFUL3和BdFUL4基因的突变体没有发现什么明显的表型，可能是由于这两个基因与其他的基因在功能上相互冗余。

目录

声明

符 号 说 明

1 引言

1.1植物开花时间调控

1.1.1模式植物拟南芥的开花时间调控

1.2禾本科作物的春化作用

1.3植物花的发育

1.3.1花的结构

1.3.2花器官的发育

1.4 APETALA1/FRUIFULL亚家族的进化过程

1.4.1双子叶植物APETALA1/FRUIFULL亚家族基因功能分化

1.4.2禾本科植物APETALA1/FRUIFULL亚家族基因功能分化

1.5温带禾本科模式作物-二穗短柄草

1.6本研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料及生长条件

2.1.2植物材料培养与处理

2.1.3酶及生化试剂

2.1.4菌株和质粒

2.2实验方法

2.2.1构建转基因植物表达载体

2.2.2根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备和质粒转化过程

2.2.3二穗短柄草的遗传转化过程

2.2.4 PCR鉴定转基因苗

2.2.5石蜡切片实验

3 结果与分析

3.1 APETALA1/FRUITFULL转录因子亚家族生物信息学分析

3.1.1 APETALA1/FRUITFULL转录因子亚家族系统进化树分析

3.1.2 APETALA1/FRUITFULL转录因子亚家族氨基酸序列比对

3.2 APETALA1/FRUITFULL转录因子亚家族基因的CRISPR/Cas9敲除

3.2.1 CRISPR/Cas9敲除二穗短柄草BdVRN1基因

3.2.2 vrn1.c1突变体的表型以及定量分析

3.2.3 CRISPR/Cas9敲除二穗短柄草BdFUL2基因

3.2.4 ful2.c1突变体的不同发育时期的表型分析

3.2.5 ful2.c1突变体结种量分析

3.2.6 ful2.c1切片观察

3.2.7 ful2.c1的互补实验和FUL2.RNAi转基因植株

3.2.8酵母双杂交分析AP1/FUL蛋白之间以及与SEP-like蛋白的互作关系

3.2.9小麦FUL2基因的过表达

3.2.10 CRISPR/Cas9敲除二穗短柄草BdFUL3和BdFUL4基因

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况及成果