二穗短柄草APETALA1/FRUITFULL亚家族及INDETERMINATE1基因功能分析

摘要

二穗短柄草（Brachypodium distachyonL.）是新的温带禾本科的模式植物。它和小麦，大麦等同属于早熟禾亚科。它具有模式植物所拥有的一些特点：基因组小，生长周期短，生长条件简单，自花授粉等。我们致力于研究二穗短柄草的抽穗期调控机制，为温带禾本科作物的遗传改良提供坚实的理论依据。
　　二穗短柄草中APETALA1/FRUITFULL亚家族功能研究
　　MADS-box转录因子家族在植物的整个发育过程特别是花器官形成过程中发挥了至关重要的作用。APETALA1/FRUITFULL（AP1/FUL）亚家族是MADS-box转录因子的一个分支。它是被子植物所特有的，伴随着被子植物的出现而出现。基因加倍是导致物种进化的重要原因，加倍后的基因可能继承祖先功能，也有可能产生新的功能。AP1/FUL基因在进化过程中发生了多次加倍。其中研究最为深入的一次加倍事件是发生在核心真双子叶，这次加倍产生了euAP1和euFUL两个基因。拟南芥中的euAP1和euFUL在花器官决定，复叶形成和成花转变等功能中发挥相互冗余而又独立的功能。在单子叶植物中也有两次明显的加倍事件：第一次发生在单子叶植物形成时，产生OsMADS18/FUL3分支；第二次发生在禾本科植物形成时，产生了 OsMADS14/FUL1/VRN1和OsMADS15/FUL2分支。它们的功能既有冗余又有分离。在小麦和大麦中，VRN1在响应春化促进开花方面扮演重要角色。OsMADS14/FUL1/VRN1和 OsMADS15/FUL2的表达模式非常相似，它们都在花序原基，小穗原基，小花原基中表达，说明它们在花序起始发育，促进小穗和小花发育中有冗余功能。另外，OsMADS15/FUL2可能在发挥A基因功能，决定外轮花器官发育中起作用。但是，目前禾本科，特别是温带禾本科植物中对AP1/FUL基因的研究还非常少。本研究中，我们分析了二穗短柄草中的四个AP1/FUL亚家族基因（BdVRN1，BdFUL2，BdFUL3和BdFUL4）的表达模式和功能。我们的主要结果和结论如下：
　　（1）BdVRN1在春化响应中发挥重要功能。实验表明，BdVRN1的表达独立于光周期受春化诱导，而BdFUL2和BdFUL3则不能。这说明就像小麦和大麦中一样，BdVRN1能记忆春化并促进开花。
　　（2）促进开花是AP1/FUL基因共有的功能。虽然BdFUL2和BdFUL3不能记忆春化，但是它们在叶片中的表达与 BdVRN1一样，在成花转变和穗发育过程中不断上升。并且长日照条件下春化的叶片中 BdFUL2和 BdFUL3的表达量要比未春化的叶片高很多。这些结果说明BdFUL2和BdFUL3可能受FT诱导。
　　（3）BdVRN1和BdFUL2在穗起始发育和小花决定功能中具有冗余作用。表达分析表明，BdVRN1和BdFUL2都能在花序原基，小穗原基和小花原基中高水平表达。在二穗短柄草中过表达BdVRN1和BdFUL2导致极早花表型，在培养基上愈伤组织就能长出穗。这说明BdVRN1和BdFUL2都具有花序决定和小花决定的功能。
　　（4）BdVRN1和BdFUL2都可以发挥A基因功能。BdVRN1和BdFUL2的过表达都导致了花器官发育的异常。有些小花的内轮花器官变成了内稃，也有些小花失去了有限生长，内轮花器官变成了额外的小穗。另外，酵母双杂交实验表明，BdVRN1和BdFUL2都可以和E类基因BdSEP和BdLHS1互作。荧光定量结果表明，BdFUL2只在外轮花器官中表达而BdVRN1的表达更为广泛。这些结果说明BdVRN1和BdFUL2都能发挥A基因的作用与E类基因互作来决定外轮花器官的发育。
　　（5）BdFUL3和BdFUL4的功能发生退化。BdFUL3和BdFUL4的过表达只导致了轻微的早花，而且没有花器官的异常。BdFUL3尚且保留了与BdVRN1和BdFUL2一致的表达模式，而BdFUL4的表达模式也已经发生改变。这些结果说明BdFUL3和BdFUL4的功能已经退化。
　　二穗短柄草中INDETERMINATE1基因功能研究
　　INDETERMINATE1（ID1）是最早在玉米中克隆的抽穗期调控因子。玉米 id1突变体表现出极度晚花的表型。ID1编码一个具有四个锌指结构的转录因子，并且具有结合DNA的能力。ID1基因只在幼叶中表达，在成熟组织中基本没有表达。它可能是位于FT同源基因ZCN8上游来调控开花。在水稻中ID1的同源基因RID1/Ehd2/OsID1同样调控抽穗期。水稻rid1突变体甚至表现出永不抽穗的表型。研究发现，ID1是禾本科植物特有的基因，在拟南芥中没有发现同源基因。玉米和水稻都是热带亚热带的禾本科植物，它们都是短日照开花而且没有春化需求。早熟禾亚科属于温带禾本科，它们在长日照开花而且有春化需求。在温带禾本科植物中，ID1同源基因是否有调控开花的功能，其作用机制是什么，我们克隆了二穗短柄草的ID1基因（BdID1），试图阐明。我们的主要研究结果和结论如下：
　　（1）BdID1能互补水稻rid1突变体的晚花表型。我们构建了35S::BdID1载体去互补水稻rid1突变体。结果表明，35S::BdID1在rid1突变体中的表达使rid1恢复了抽穗。这说明BdID1在功能上可以互补RID1。
　　（2）BdID1在分裂和生长旺盛的部位表达。荧光定量实验表明，BdID1在幼叶，幼穗中高水平表达，而在成熟组织中则鲜有表达。这个结果与玉米和水稻中是一致的，说明ID1基因主要在细胞分裂和生长旺盛的部位表达。
　　（3）BdID1具有调控抽穗的功能。我们在短柄草中过表达BdID1。过表达植株表现出不同程度的早花，有些植株是极早花表型。用 CRISPR/Cas9敲除 BdID1后的植株表现出极度晚花的表型，超过150天没有任何抽穗迹象。因此，二穗短柄草BdID1也具有调控抽穗的功能。
　　（4）BdID1促进开花依赖于长日照。BdID1的过表达植株在短日照条件下没有表现出像长日照条件下的早花表型，这说明BdID1促进开花时依赖于长日照条件。它可能与光周期途径的基因并列调控FT。
　　（5）BdID1功能缺失突变体的晚花表型可以被春化逆转。经过两个月的春化处理， BdID1突变体在90天左右抽穗。也就是说BdID1突变体对春化依然敏感，可以正常的感受春化并且促进开花。

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1前言

1.1植物开花时间调控

1.1.1拟南芥开花时间调控机制

1.1.2温带禾本科作物的开花时间调控

1.2 APETALA1/FRUITFULL亚家族的基因加倍和功能分化

1.2.1双子叶植物AP1/FUL亚家族的基因加倍和功能分化

1.2.2禾本科植物AP1/FUL亚家族的基因加倍和功能分化

1.3禾本科INDETERMINATE1基因的克隆和功能研究

1.4温带禾本科模式植物-二穗短柄草

1.5本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料和生长条件

2.1.2菌株和质粒

2.1.3酶及生化试剂

2.2方法

2.2.1构建转基因植物表达载体

2.2.2根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备和转化

2.2.3二穗短柄草遗传转化

2.2.4 PCR鉴定转基因苗

2.2.5荧光定量PCR

2.2.6原位杂交分析

3结果与分析

3.1二穗短柄草AP1/FUL亚家族的功能分析

3.1.1 二穗短柄草AP1/FUL亚家族基因进化树分析和氨基酸多序列比对

3.1.2成花转变和花序发育过程中二穗短柄草AP1/FUL基因的表达模式

3.1.3春化对二穗短柄草AP1/FUL基因表达模式的影响

3.1.4幼穗中二穗短柄草AP1/FUL基因表达的分布

3.1.5二穗短柄草AP1/FUL基因在花器官中的表达模式

3.1.6短柄草AP1/FUL基因的过表达引起早花

3.1.7过表达BdVRN1和BdFUL2引起严重的花器官发育异常

3.1.8酵母双杂交分析二穗短柄草AP1/FUL蛋白和SEP-like蛋白的互作

3.2二穗短柄草BdID1基因的功能分析

3.2.1二穗短柄草中的IDD转录因子家族和ID1同源蛋白

3.2.2 BdID1定位于细胞核中

3.2.3 35S::BdID1能使水稻rid1突变体恢复抽穗

3.2.4 BdID1在分裂和生长旺盛的部位表达较高

3.2.5光周期和春化作用对BdID1表达的影响

3.2.6短柄草中过表达BdID1和小麦ID1导致早花和矮小表型

3.2.7用35S启动子过表达BdID1的表型分析

3.2.8 35S::BdID1植株对日照长度敏感

3.2.9用CRISPR/Cas9敲除BdID1基因

3.2.10 Bdid1-2突变体中开花调控相关基因的表达量变化

3.2.11 Bdid1-2突变体对春化敏感

4讨论

5结论

参考文献

致谢

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