Paenibacillus Polymyxa SC2的ARTP诱变及其突变株的基因组与转录组测序分析

摘要

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）SC2筛选自辣椒根际，能够改善植物的营养环境，分泌抗菌物质抑制病原微生物的生长，分泌生长激素和植物生长所需的其他活性物质。常压室温等离子体技术作为一种快速高效诱变技术，具有突变率高，操作简便、安全性高、诱变速度快等优点而被广泛应用于原核生物（细菌、放线菌）和真核生物（霉菌 、酵母、微藻）。采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术处理多粘类芽孢杆菌SC2以期获得不同功能的突变株。 实验最终确定诱变条件为：功率120W、气量10slm、照射时长25s、致死率92%。以大肠杆菌为指示菌，结合平板对峙法和牛津杯法，最终获得了1株不产多粘菌素的突变株PM3、5株多粘菌素产量提高的突变株：C520、F373、I31、I135、I300抑菌圈直径分别增加了 2.0mm、2.54mm、2.32mm、2.3mm、1.95mm。另外还得到两株产胞外多糖突变株，突变株EM1的胞外多糖产量明显减少且变的透明。突变株EM2胞外多糖产量明显增加且具有流动性。经过对各突变株表型性状检测发现，各突变株在菌落形态，芽孢形成，拮抗真菌，运动性和生长能力上各发生了不同的改变。 将各突变株进行了基因组重测序，发现各突变株均产生了大量的结构变异，主要是大片段的缺失和插入。PM3在基因组上共发生2处SNP，2处Small InDel，85处SV包括1处INS和74处DEL。通过对突变株PM3进行转录组测序发现共有903个差显基因（log2FC >2），其中有416个基因上调，487个基因下调。PM3的多粘菌素合成基因簇包括pmxA、pmxB、pmxC、pmxD和pmxE均没有发生突变，而pmxA、pmxB、pmxC和pmxE在转录组表达水平上发生了上调，这个现象说明合成基因仍然完整且转录正常，但多粘菌素的合成或活性受到了影响。通过转录组生物信息学分析发现基因ectB发生了明显下调（log2FC=-11.61），该基因合成的酶是多粘菌素前体物质2,4-二氨基丁酸合成所必需的。另外，关于脂肪酸代谢合成的基因acpS、accB、fabG5、fabH3、fabD5、fabD3、fabG13、bioB1、bioB3均发生了下调，脂肪酸的合成受到了影响。因为多粘菌素是由氨基酸组成的肽环和脂肪酸所构成，所以多粘菌素合成所需的 2,4-二氨基丁酸和脂肪酸合成相关基因的下调可能影响了多粘菌素的合成，从而导致突变株PM3 抑制细菌能力的丧失。通过添加外源 L-2,4-二氨基丁酸二盐酸盐，突变株 PM3产生了抑菌圈，恢复了合成多粘菌素的能力，所以2,4-二氨基丁酸的缺失是造成PM3不产生多粘菌素的主要原因。 综上所述，通过常压室温等离子体诱变多粘类芽孢杆菌SC2，获得了不同类型的功能突变株，并利用全基因组测序和转录组测序技术对其次级代谢产物合成机理进行了初步的研究，表明等离子体诱变技术对于多粘类芽孢杆菌育种以及研究代谢物质合成机制具有一定的潜力，并且有可能成为研究SC2功能基因组学的新方法。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1多粘类芽孢杆菌

1.2多粘类芽孢杆菌SC2

1.3非核糖体肽合成机制

1.4胞外多糖研究现状

1.5诱变育种方法

1.6全基因组重测序和转录组测序

1.7研究目的意义，研究内容，技术路线

2 材料和方法

2.1供试菌株

2.2培养基

2.3仪器与设备

2.4实验方法

3 结果与分析

3.1诱变条件的确定

3.2突变株16S rDNA测序

3.3功能突变株筛选

3.4突变株与SC2表型性状差异

3.5突变株基因组重测序

3.6 SC2和PM3转录组测序

4 讨论

（ 1） ARTP 诱变条件的确定

（ 2） ARTP 诱变对遗传物质的损伤

（ 3） PM3 失去产多粘菌素能力的原因

5 结论

参考文献

致谢