毛皮动物犬瘟热病毒分离鉴定及分子生物学特性研究

摘要

2015年6月至2016年6月，对山东省中东部地区送检的118份病死水貂、貉子和狐狸肺脏病料检测，水貂83份、貉子17份、狐狸18份。根据Genbank已发表犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV) N基因高度保守区域设计引物，建立了其RT-PCR检测方法，阳性结果为71份、13份与13份，阳性率为85.54％、76.47%与72.22%。选取部分阳性病料经MDCK细胞分离，貂源分离获得4株CDV，貉源分离1株，狐源没有分离得到，5株分离株分别命名为 CDV103、CDV114、CDV122、CDVDH2与 CDV LC2株。接种细胞后部分样品呈现明显 CPE亦有部分样品无明显 CPE，经 RT-PCR检测分析发现部分无 CPE细胞冻融液检测结果呈阳性，表明 CDV对 MDCK细胞的适应性有所不同。根据 Genbank已发表的 CDV F、H与 N全基因序列分别设计扩增 F、H与N全基因的特异性引物，研究CDV分子生物学特性。采用RT-PCR扩增及琼脂凝胶回收、克隆，对克隆纯化获得的相关片段测序与分析。
　　经 DNAstar软件对分离株核苷酸与氨基酸序列分析，根据 Genbank中已发表的犬瘟热毒株作参考株，构建遗传进化树分析。H基因核苷酸序列分析结果：CDV103、C DV114、CDV122、CDVDH2与CDVLC2株彼此同源性为90.7%-100.0%，CDVLC2与CDVDH2株的同源性最高100.0%，CDVLC2、CDVDH2株与CDV103、CDV114、CD V122株彼此间有相对较高同源性为90.7%-91.1%。H蛋白氨基酸序列潜在的 N-联糖基化位点分析结果：CDV103、CDV114与 CDV122株糖基化位点均为9个；第309-311位糖基化位点为野毒株所独有得，Asia-1型中部分毒株具有9个潜在 N-联糖基化位点，CDVDH2与CDVLC2毒株糖基化位点位7个，这与Convac弱毒疫苗株H蛋白氨基酸序列的糖基化位点一致。H基因遗传进化树分析结果：CDV103、CDV114与CDV122株属于 Asia-1型，与 JN（08）（2009ChinaFJ810213fox）株有较近亲缘关系；CD VDH2与 CDVLC2分离株属于 America-1型，与 Convac、Onderstepoort疫苗株关系较近。
　　F基因核苷酸序列分析结果：CDV103、CDV114、CDV122、CDVDH2与 CDVLC2株核苷酸序列同源性为90.3%-99.0%，CDV103、CDV114与CDV122株同Onderstepo ort疫苗株同源性为90.4%-90.7%，CDVDH2、CDVLC2株与 Onderstepoort疫苗株同源性最高为99.0%。Fsp推导氨基酸序列潜在 N-联糖基化位点分析结果：CDV103、CDV114与CDV122株均含有2个潜在的N-联糖基化位点，位于第62位和108位，CDV103、CDV114与 CDV122株糖基化位与 Asia-1型毒株一致。F基因构建遗传进化树分析结果：5株CDV划分于2个基因型，CDV103、CDV114与CDV122株属于Asia-1型，与 ZYL（2016ChinaKX499865fox）株存在较近亲缘关系；CDVDH2与 CDVLC2株属于America-1型，同Onderstepoort疫苗株关系较近。
　　N基因核苷酸序列分析结果：CDV103、CDV114、CDV122、CDVDH2与CDVLC2株彼此间同源性均高于99.5%，为99.5%-100.0%，CDV103与CDV114株相似性最高为100.0%，CDVLC2与CDVDH2株同源性最低为99.5%。N蛋白氨基酸序列存在较高同源性，5株分离株彼此同源性为99.0%-100.0%。与 Onderstepoort弱毒疫苗株相似性较高，为98.3%-98.9%；N基因遗传进化树分析结果：5株分离株与 Onderstepoort疫苗株存在较近亲缘关系，划分于America-1型。
　　本研究对山东省中东部地区毛皮动物犬瘟热病毒流行病学调查，分离鉴定，主要基因测序，构建遗传进化发生树。本研究主要克服犬瘟热病毒分离困难的问题，总结犬瘟热病毒分离过程中的经验。为做好犬瘟热病毒防制和监测等相关工作提供了重要的分子流行病学资料。为犬瘟热病毒分子生物学提供了最新的调查数据。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1犬瘟热病毒的基本特征

1.1.1犬瘟热病毒的宿主亲嗜性

1.1.2犬瘟热病毒的培养特性

1.1.3犬瘟热病毒的抵抗力

1.2犬瘟热病毒基因组物质组成

1.2.1核蛋白（nucleocapsid protein N）

1.2.2磷蛋白（phospho protein P）

1.2.3基质蛋白（matrix protein M）

1.2.4融合蛋白（fusion protein F）

1.2.5附着和血凝素蛋白（attachment protein or hemagglutinin protein H）

1.2.6大聚合酶蛋白（large polymerase protein L）

1.3犬瘟热病毒的复制及致病性

1.3.1犬瘟热病毒的复制机理

1.3.2犬瘟热病毒的致病机理

1.3.3犬瘟热病毒的遗传变异

1.4 犬瘟热病毒诊断技术

1.4.1包涵体的检查

1.4.2酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.4.3免疫胶体金技术（GICT）

1.4.4免疫荧光抗体方法（FA）

1.4.5免疫组化技术（IHC）

1.4.6核酸杂交技术（ISH）

1.4.7逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription PCR）

1.4.8多重聚合酶链式反应

1.4.9巢式逆转录聚合酶链式反应（nested RT-PCR）

1.4.10离子捕获电镜诊断

1.4.11环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）

1.4.12实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）

1.5 犬瘟热病毒动物模型研究

1.6 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1病料及病毒

2.1.2主要仪器和试剂

2.1.3 引物设计

2.1.4 参考毒株

2.2试验方法

2.2.1疑似病料检测及H、F、N全基因克隆测序

2.2.2分离毒株基因分析

3 结果

3.1疑似病料检测

3.1.3检测引物重复性试验结果

3.1.4犬瘟热病例样品检测结果

3.2 CDV分离结果

3.3 H、F与N全基因扩增结果

3.4 酶切鉴定结果

3.5 同源性与系统发育分析结果

3.5.1 N基因分析结果

3.5.2 H基因分析结果

3.5.3 F基因分析结果

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢