烟草脉带花叶病毒和马铃薯X病毒的协生作用及二者侵染本氏烟的转录组学分析

摘要

马铃薯Y病毒属成员与马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）在生产中常常复合侵染植株产生协生作用，引起更为严重的症状。烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）是马铃薯Y病毒属的一个确定种，能够自然侵染烟草、马铃薯、番茄等茄科作物，在生产中的危害逐年加重。随着高通量测序技术的应用，利用转录组测序技术对植物转录本分析的研究逐渐成为热点，但是应用于研究病毒协生作用的分子机制方面的报道还很少。本研究以实验室自主构建的携带GFP的TVBMV侵染性克隆、将HC-Pro的CDN基序中D198突变为K并将中间区域的IGN突变为DEN而失去协生能力的弱毒突变体以及PVX侵染性克隆为基础，研究TVBMV与PVX的协生作用，并利用RNA-Seq技术研究TVBMV野生型及弱毒突变体分别与PVX复合侵染本氏烟过程中差异表达的寄主基因，研究马铃薯Y病毒属病毒与PVX协生作用影响的寄主代谢通路；利用小RNA测序技术鉴定侵染芝麻的病毒种类，克隆获得1个TVBMV芝麻分离物的全基因组序列并分析了其分子变异情况。具体结果如下：
　　从病害症状、病毒含量等方面研究了TVBMV与PVX的协生。本氏烟接种PVX后第10天，系统叶片表现花叶症状；TVBMV与PVX共同接种本氏烟，在系统叶片引起花叶及卷曲症状，导致植株生长迟缓；弱毒突变体与PVX共同接种本氏烟，仅在植株上部叶片引起轻微的花叶症状。TVBMV与PVX共同接种后第14天，本氏烟植株出现矮化和坏死，弱毒突变体与PVX复合侵染仅引起与PVX相同的花叶症状。共同接种本氏烟后第20天，TVBMV与PVX协生加重了病害症状、显著抑制烟草植株的生长，并造成了植株顶部叶片的坏死，而无协生作用的弱毒突变体与PVX复合侵染仅造成了与PVX单独侵染相似的花叶症状。ELISA检测结果表明，TVBMV与PVX复合侵染在接种后第6天TVBMV病毒积累量开始明显升高，并且与单独接种TVBMV的本氏烟中病毒积累量相当；弱毒突变体与PVX复合侵染后TVBMV病毒积累量远低于野生型TVBMV与PVX复合侵染的本氏烟，且病毒积累量一直维持在较低水平。
　　利用RNA-Seq技术研究了TVBMV野生型及弱毒突变体分别与PVX复合侵染过程中本氏烟的转录组变化情况。病毒在接种后第2天大量复制，接种后第2天的接种叶片及第10天的系统叶片中均含有大量的病毒RNA，clean reads能比到本氏烟参考基因组上的较少。GO富集分析显示，TVBMV与PVX的复合侵染导致大量寄主基因发生异常表达，干扰了寄主的正常代谢，影响了寄主蛋白和酶代谢相关基因、DNA复制相关基因、光合作用相关基因等，使寄主产生一系列的细胞组分、生物过程、分子功能的改变。与弱毒突变体与PVX的侵染相比，侵染前期TVBMV与PVX协生影响DNA复制通路17个基因上调表达，系统侵染后造成与细胞壁合成相关的33个基因和与光合作用相关的蛋白复合体及外周天线61个基因的下调表达以及RNA沉默途径DCL2和RDR1基因的上调表达。KEGG分析表明，与弱毒突变体与PVX的侵染相比，TVBMV与PVX协生，诱导核糖体合成相关基因的表达以帮助病毒蛋白合成；之后通过抑制光合作用相关代谢通路，抑制细胞壁合成相关酶的代谢通路，调节激素介导的信号转导通路，引起植株的花叶和坏死。同时，植物的SA信号途径受到诱导，产生大量PR蛋白以防御病毒的侵染。
　　将从济南章丘芝麻田中采集的表现黄绿花叶、细叶及皱缩的芝麻病株叶片进行小RNA测序，检测到西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、菜豆普通花叶病毒（Bean common mosaic virus，BCMV）和烟草脉带花叶病毒（TVBMV）等三种马铃薯Y病毒属病毒，其中TVBMV能够自然侵染芝麻系首次报道，也是TVBMV能够侵染除茄科以外作物的首次报道。
　　进一步RT-PCR及血清学检测证实了小RNA的测序结果。利用步移扩增和5' RACE方法获得了TVBMV-Zhangqiu分离物的全基因组序列，其全基因组序列为9596个核苷酸。TVBMV-Zhangqiu分离物与山东沂源的YY分离物（JN630472）的核苷酸及氨基酸一致率最高，分别为97.89％和99.06%；系统进化分析表明，TVBMV-Zhangqiu分离物聚类到来源于中国大陆的MC组；重组分析表明TVBMV-Zhangqiu分离物是SDYS1与YN分离物的潜在重组体，属于MC组的组内重组，其基因组的主要亲本是SDYS1，8642 nt-9533 nt来源于YN；TVBMV-Zhangqiu与TVBMV-HN39接种芝麻的症状存在差异， Zhangqiu分离物接种后仅表现轻花叶症状，HN39分离物接种后的芝麻植株花叶明显且生长迟缓、植株矮化。

目录

声明

符 号 说 明

前言

1.1烟草脉带花叶病毒

1.1.1 发生与危害

1.1.2全基因组序列与结构

1.1.3蛋白序列及功能的研究

1.2 马铃薯X病毒

1.3 病毒的相互作用

1. 3. 1协生作用

1. 3. 2拮抗作用

1.4二代测序在植物病毒研究中的应用

1.4.1二代测序技术研究病毒与寄主植物的互作

1.4.2 二代测序技术鉴定植物病毒

1.5 芝麻病毒病

1.6 本研究的目的意义

材料与方法

2.1材料

2.1.1 样品及毒原

2.1.2 供试植物

2.1.5生化试剂、试剂盒与酶

2.1.6 寡聚核苷酸引物

2.1.7主要实验仪器

2.2方法

2.2.1 侵染性克隆的接种

2.2.2间接ELISA法检测病毒积累量

2.2.3 RT-PCR检测病毒

2.2.4 本氏烟的转录组数据分析

2.2.5芝麻病叶的小RNA测序

2.2.6验证小RNA测序结果

2.2.7 TVBMV芝麻分离物全基因组序列测定

2.2.8 TVBMV芝麻分离物全基因组序列分析

结果与分析

3.1 TVBMV与PVX的协生

3.1.1 TVBMV野生型及弱毒突变体T-HCm与PVX侵染本氏烟的症状

3.1.2检测TVBMV野生型及弱毒突变体与PVX侵染本氏烟病毒的积累量

3.2 TVBMV野生型及弱毒突变体与PVX复合侵染的转录组学分析

3.2.1 RNA样品的提取及质量检测

3.2.2 测序数据的初步分析

3.2.3 基因表达水平分析

3.2.4 基因差异表达分析

3.2.5 差异基因的GO富集分析

3.2.6 差异基因的KEGG 富集分析

3.2.7 荧光定量RT-PCR验证RNA-seq数据的准确性

3.2.8 荧光定量PCR验证关键通路基因

3.2.9协生引起的病害症状的相关因子

3.3感病芝麻样品的小RNA测序及分析

3.3.1 感病芝麻样品的田间症状

3.3.2 RNA样品的提取及质量检测

3.3.3 序列处理

3.3.4 小RNA测序结果

3.3.5 RT-PCR检测芝麻样品中的TVBMV

3.3.6 序列测定及分析

3.3.7 Western blotting检测芝麻样品TVBMV蛋白表达水平

3.4 TVBMV芝麻分离物全基因组测序及分析

3.4.1 RT-PCR结果

3.4.2序列测定

3.4.3基因组结构

3.4.4核苷酸和氨基酸一致率

3.4.5 系统进化关系

3.4.6重组分析

3.4.7生物学性状

3.4.8全基因组序列

讨论

4.1病毒的协生作用

4.2病毒复合侵染本氏烟引起的转录组变化

4.3 协生作用与单独侵染本氏烟的转录组数据比较

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况