牛关节软骨Ⅱ型胶原的制备及其对骨形成的影响

摘要

胶原是构成哺乳动物细胞外基质的主要蛋白质。目前脊椎动物中已发现28种胶原，其中II型胶原主要分布于关节软骨中，对类风湿性关节炎、软骨发育不良等疾病具有显著疗效。传统的II型胶原鉴定方法如溴化氢降解法、Elisa法等方法无法同时进行类型识别和定量检测，且存在精确度低等问题。本文采用酶法制备了牛关节软骨中的II型胶原，并以II型胶原的特征多肽为基础，建立了一种II型胶原质谱定性定量检测方法；同时将胶原覆层材料用于小鼠前成骨细胞培养，在基于质谱的蛋白质组学研究基础上，考察了不同类型胶原对细胞不同功能性蛋白表达的影响，在此基础上研究II型胶原对细胞分化方向及骨形成的影响，在未来的功能食品、药品及生物材料等领域具有广泛的应用前景。主要结论如下：
　　1.采用酶法提取了牛关节软骨中的II型胶原，并对制备的II型胶原进行鉴定。采用氯化钠除杂和盐酸胍抽提蛋白多糖后，在酸性条件下采用胃蛋白酶降解非胶原类蛋白，经盐析和透析处理去除多肽，冷冻干燥后获得II型胶原。SDS-PAGE结果表明牛II型胶原单条链分子量约为130 kDa；胶原酶解产物中检测出牛II型胶原的特征多肽，质谱分析结果表明II型胶原的纯度为92.2％，与氨基酸组成分析结果一致，II型胶原得率为9.2%；TEM可观测到II型胶原特有的超分子结构；DSC结果表明制备的II型胶原在pH7.0条件下变性温度Tm为43.68℃，且在酸性条件下较不稳定。结果表明实验所用方法可得到纯度较高的II型胶原，鉴定结果符合II型胶原特性。
　　2.采用化学偶联法将I型胶原和II型胶原覆层在硅片上，并采用质谱法对硅片表面覆层的胶原进行定量。以氨基硅烷和戊二醛为偶联剂，将经Piranha溶液处理的硅片进行胶原覆层，XPS分析结果表明经氨基硅烷处理的硅片表面氮含量有所增加，氨基硅烷成功偶联在硅片表面；采用HPLC-MS法对硅片表面覆层的胶原进行定量，得到Φ10 cm硅片表面I型胶原覆层量为0.81 mg，II型胶原覆层量为0.67 mg。
　　3.采用胶原覆层硅片培养小鼠前成骨细胞，并通过细胞培养效果评价其生物相容性。与空白硅片相比，经胶原覆层后的硅片细胞贴附状态显著改善，细胞增殖速率和细胞活性均显著提高，结果表明胶原覆层可增强硅片的生物相容性。
　　4.对细胞蛋白进行差异性分析，并比较胶原类型对细胞分化的影响。将硅片表面培养的细胞裂解后提取细胞蛋白，经HPLC-MS分析后进行蛋白质组学研究，结果表明经I型胶原覆层的硅片培养的细胞多表达与细胞增殖期和基质合成有关的基础蛋白，而经II型胶原覆层的硅片培养的细胞多表达与钙盐沉积有关的蛋白。结果表明II型胶原对骨形成具有一定的促进作用。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1胶原概况及研究意义

1.2 II型胶原的制备方法

1.3 II型胶原的研究方法

1.4胶原覆层方法及其在生物材料中的应用

1.5立题依据与研究内容

2实验材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3分析方法

3结果与分析

3.1 II型胶原性质分析

3.2胶原材料表面改性应用评价

3.3细胞蛋白组学分析

4讨论

4.1 II型胶原制备

4.2胶原质谱定量

4.3胶原覆层生物材料

4.4胶原对骨形成的影响

5结论

5.1主要研究成果

5.2创新点

5.3工作展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况