皮质骨Ⅰ型胶原的提取及胶原—明胶神经修复支架材料的制备

摘要

周围神经缺损后的修复再生和功能恢复一直是神经科学领域研究的难点和热点。由于周围神经结构和功能上的特殊性，损伤后大多数情况下无法直接对拉吻合，损伤远端神经纤维发生瓦勒变性，导致肢体感觉缺失，活动障碍，功能丧失，其中神经断裂、神经缺损又是最为严重的损伤类型。对于周围神经损伤的治疗，临床上应用较广、疗效较肯定的方法是自体神经移植。但由于自体神经移植的来源不足、供区继发损伤等原因大大限制了其实际应用。近年来，应用组织工程技术构建神经支架材料复合体――人工神经修复周围神经损伤成为研究的重点。
　　以天然的细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）为原料制备神经修复支架材料是研究的新方向。ECM具有细胞粘附、细胞间信号传递、迁移等功能。用ECM制成的神经组织工程材料不仅具有良好的生物相容性及可降解性,而且有利于神经纤维的迁延和生长。ECM还具有最接近人体的网架结构、良好的生物相容性及生物力学性能，其表面具备细胞膜受体识别位点，能引导或诱导组织再生，作为神经修复支架材料，可望在周围神经组织工程的构建中取得良好效果。
　　胶原（Collagen）是ECM的主要成分，广泛分布于骨、肌腱、韧带、皮肤、软骨等结缔组织中，约占动物体内蛋白质总量的1/4～1/3，在细胞的分化、运动化趋向、结缔组织修复等方面发挥重要作用，同时具有生物可降解性、低抗原性、低毒性、能诱导细胞再生及易获得性等诸多优点，可促进雪旺细胞（Schwanncells，SCs）分裂、增殖及轴突生长和功能恢复，有利于组织培养中的细胞粘附、抗压和维持空间结构的功能。胶原可参与组织愈合过程，在软骨细胞再生诱导、角膜移植、人工皮肤制备等方面得到广泛应用，应用在周围神经损伤修复中亦能刺激和改善神经的再生。
　　本实验在传统的酶提取法基础上加以改进和细化，提取纯化牛皮质骨中Ⅰ型胶原，应用于制备神经修复支架材料并检验其仿生学效果，探索一种简化实用的皮质骨胶原提取方法，为基础研究和临床应用提供纯度较高、价格低廉的胶原原料。
　　实验中主要应用脱脂脱钙法制备皮质骨基质粉，再通过胃蛋白酶促骨基质粉溶解，反复盐析、抽提，冻干后获得海绵状胶原样品并进行氨基酸分析、SDS-PAGE电泳等方法检验其性质。以实验获得的胶原样品和明胶为主要原料，利用本实验室专利技术构建支架材料加以检验。结果证实：
　　1、将骨块粉碎至直径为0.6mm～2mm的骨粉颗粒，脱脂48h后，以0.6mol/l盐酸脱钙持续84h，分别于第12h，36h，60h换脱钙液，方法简便，成本低廉，脱钙效果明确。
　　2、将骨基质粉浸在500ml0.05mol/l冰醋酸和500mg胃蛋白酶混合溶液中，持续促溶96h后高速低温离心，反复盐析、抽提，最后透析，浓缩冻干。经氨基酸分析、SDS-PAGE电泳等方法验证，获得了纯度较高的胶原样品。
　　3、以实验获得的Ⅰ型胶原和明胶为主要原料，构建神经支架材料，其内径在20μm～100μm，三维结构上接近于坐骨神经，具有一定的仿生效果。
　　实验通过酶促溶脱钙骨基质粉获得了纯度较高的Ⅰ型胶原。以获得的Ⅰ型胶原和明胶为主要原料构建具有微管排列结构的支架材料，其内径在20μm～100μm，三维结构上接近于坐骨神经，具有一定的仿生效果。该类型支架材料具有良好的生物相容性。综上所述，作者制备的皮质骨胶原，具有较高的纯度，并可用于胶原蛋白材料的制备，具有较好的实用价值。

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中文摘要

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前言

文献回顾

一、周围神经损伤及治疗现状

二、周围神经组织工程

三、生物支架材料

四、胶原概述

五、胶原提取方法及提取原料

皮质骨Ⅰ型胶原的提取及胶原－明胶神经修复支架材料的制备

实验一Ⅰ型胶原的提取及神经修复支架材料的制备

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历

致谢