胶原结合碱性成纤维细胞生长因子联合胶原支架促进坐骨神经横断伤修复研究

摘要

研究背景和目的：
　　 周围神经损伤(PNI)是当今社会中一个常见的问题。它常常导致患者功能的丧失，影响患者的生活质量。由于产伤、车祸或暴力伤等引起的周围神经损伤会导致感觉或运动神经元的变性坏死。尽管周围神经有再生的能力，但其功能恢复很不理想。根据神经损伤的程度、严重性、缺损的长度及轴突再生所需的时间的不同，功能的恢复程度也不同。在人类和哺乳动物动物，轴突的再生速度很慢（1或3毫米/天）。在临床上，根据神经纤维的损伤和神经连续性的丧失程度不同，周围神经损伤常分为3类:(1)神经压伤（有或无去髓鞘化）。(2)轴突断伤（但神经内膜和神经束膜保留）。(3)神经横断伤（神经内膜、束膜的连续性被破坏）。神经损伤后轴突再生和髓鞘化可能对功能的恢复有帮助。
　　 人工神经研究的不断发展，有力地促进了神经轴突的再生和功能恢复。近几年的研究发现，人们在可降解或不可降解的神经导管材料研究中取得了一些进展。然而它们尚存在一定的局限性使得人们继续探索更有效的策略以促进周围神经损伤再生。
　　 胶原材料在组织工程中是较好的材料之一。胶原材料因其低免疫原性和较好的可降解性而被广泛应用于组织再生。在本研究中，我们使用胶原导管来连接坐骨神经近远两断端间的缺损，从而起到桥接作用，有序胶原材料(LOCS)填充于神经导管中，共同组成神经损伤修复胶原生物材料。前期的研究表明，神经以不正确的方式生长可能导致再生的神经失去功能。我们实验室之前的研究证实有序胶原材料(LOCS)是一种新型的神经引导材料。除此之外，有序胶原材料还可以被用来结合神经营养因子或作为携带药物的载体。
　　 另一方面，在周围神经系统中生长因子对促进神经生长起重要作用。其中碱性成纤维细胞生长因子是一种重要的生长因子，它能促进轴突再生，对于施万细胞，体内和体外的研究证实碱性成纤维细胞生长因子能刺激施万细胞的增殖。然而，应用碱性成纤维细胞生长因子溶液体内应用后因为其半衰期短、在体液冲刷后大量扩散，因而并不能取得满意的治疗效果。为了在治疗部位达到有效的药物浓度，周期性注射用药或大剂量给药是常用的方法。但这样的方法会招致感染或严重的副作用。因此，我们将胶原结合区融合在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的一端从而构建了CBD-bFGF。CBD-bFGF与胶原有较强的亲和力，同时与bFGF有相同的生物活性。随后，将CBD-bFGF与有序胶原材料特异结合以控制它的释放速度。
　　 目的:在本研究中，我们将改造的CBD-bFGF、有序胶原材料和胶原导管联合应用从而构建出一种天然的功能生物材料，随后我们将此功能生物材料用于大鼠坐骨神经5毫米缺损的横断伤中，以促进神经再生。
　　 方法：
　　 (1) CBD-bFGF和天然碱性成纤维细胞生长因子(NAT-bFGF)的制备。使用我们实验室之前的方法。将CBD-bFGF的基因序列用PCR扩增出来并插入到pET-28a质粒中。将该质粒转入到BL21(DE3)大肠杆菌中。随后，用IPTG诱导蛋白的表达。用琼脂糖镍柱从上清中将目的蛋白纯化出来。使用相同的方法将天然碱性成纤维细胞生长因子构建出来。用Bradfod法测量蛋白的浓度。(2)有序胶原材料和胶原管的准备。有序胶原材料来源于牛筋膜。胶原管来源于胶原膜。将胶原膜卷在模子上并交联，将胶原管用NaH2PO4和蒸馏水洗干净后冻干。将有序胶原材料切成5毫米长，胶原管切成7毫米长并辐照除菌。将CBD-bFGF、NAT-bFGF和PBS分别加在有序胶原材料上。(3)外周神经损伤动物模型制备。将所有的雄性大鼠分为3组，包括神经缺损用胶原管和LOCS+CBD-bFGF连接（LOCS+CBD-bFGF组）;神经缺损用胶原管和LOCS+NAT-bFGF连接(LOCS+NAT-bFGF组);神经缺损用胶原管和LOCS+PBS连接（LOCS+PBS组）。使用戊巴比妥钠腹腔注射将大鼠麻醉。将大鼠右侧的坐骨神经暴露，剪去神经干3毫米，由于神经的回缩而造成5毫米的缺损。随后将携带因子的有序胶原材料填充于胶原导管并用9/0的尼龙线将导管缝在神经的两断端。在胶原管移植治疗后的第六和第十二周用腹腔注射过量麻药的方法将大鼠处死。(4)行走足迹分析。使用Bain的方法计算坐骨神经功能指数，记录下白纸上大鼠脚印并通过公式计算SFI值。(5)电生理评价。在第十二周，大鼠被麻醉后，重新暴露出再生的坐骨神经。将钩状的双刺激电极放在神经近端，两刺激电极放在神经的近远两端，用电生理仪记录神经传导速度。(6)荧光金逆行示踪。在第十周将大鼠麻醉。重新暴露坐骨神经，将荧光金注射在神经的远端，分层缝合后将大鼠饲养两周，在第十二周时处死。将大鼠L4到L6的背根神经节取出做冰冻切片。在荧光显微镜下计数发出金黄色荧光的感觉神经元。(7)在第六和第十二周，取出大鼠新生神经，固定后做石蜡切片。将切片用来做免疫组化。使用的一抗为NF和S-100，用软件统计NF和S-100的阳性面积比（阳性面积/总面积）。一些切片被用来做坚牢蓝染色，统计新生神经的数量和直径，通过做透射电镜来观察髓鞘的厚度。一些新生神经通过做HE染色来观察轴突再生的有序结构。(8)腓肠肌恢复率和马松三色染色。我们测量了腓肠肌重量恢复率。大鼠被处死后双侧的腓肠肌被分离并在电子天平上称得湿重。通过患侧肌肉重量与健侧肌肉重量的比值测得腓肠肌恢复率。之后将腓肠肌做石蜡切片并做马松三色染色。统计肌肉的阳性面积比（肌肉面积/总面积）。
　　 统计学处理
　　 文章中所使用的统计学方法为多样本间多重比较中的S-N-K法。所使用的统计学软件为SPSS13.0。将统计后的数据表示为均数±标准误。将P值＜0.05或P＜0.01视为统计学上差别有统计学意义。并且在本文中的表达为*P＜0.05或**P＜0.01。
　　 结果：
　　 (1)神经导管的概况。第十二周时，神经缺口被有效地连接起来。胶原管被吸收了，被类似神经的组织所代替。新生神经与周围组织间没有发现严重的粘连。(2)行走足迹分析。坐骨神经功能指数在-100到0之间，0代表正常神经功能。-100代表神经功能的完全丧失。在第四周前，三组之间没有显著性差异。从第五周开始，坐骨神经功能指数在各组间的差别有统计学意义。其中坐骨神经功能指数在LOCS+NAT-bFGF组的值要高于LOCS+PBS组，但坐骨神经功能指数在LOCS+NAT-bFGF组的值要低于LOCS+CBD-bFGF组。(3)电生理学评价。我们发现在第12周各组的大鼠恢复到了不同的程度。神经传导速度在LOCS+CBD-bFGF组和LOCS+NAT-bFGF组要比LOCS+PBS组要快。同时神经传导速度在LOCS+CBD-bFGF组和LOCS+NAT-bFGF组之间的差别有统计学意义。(4)荧光金逆行示踪。在术后第12周。荧光金所标记的背根神经节感觉神经元在紫外激发下呈现出金黄色。在各组将被标记的感觉神经元计数。统计学结果显示用LOCS+CBD-bFGF处理的组感觉神经纤维的恢复要比LOCS+NAT-bFGF组和LOCS+PBS组好。被标记的感觉神经元的数量在LOCS+NAT-bFGF组要比LOCS+PBS组高。(5)组织和形态学分析。通过HE染色。我们发现在有序胶原材料的引导下，三个组（LOCS+CBD-bFGF组、LOCS+NAT-bFGF组、LOCS+PBS组）的神经再生均呈现出有序的结构。为了评价新生神经的再生轴突的数量和分布。在第6周和第12周，我们用NF一抗做了免疫组化。LOCS+CBD-bFGF组显示了最好的轴突的恢复，而在LOCS+PBS组只显示了稀少的NF的阳性面积。各组间的差别有统计学意义。S-100染色可以评价再生神经施万细胞的增殖情况，施万细胞的增殖对轴突的再生非常重要。定量分析显示，在第6周和第12周，S-100的阳性面积比在LOCS+CBD-bFGF组要高于LOCS+NAT-bFGF组和LOCS+PBS组。而且与LOCS+PBS组相比，LOCS+NAT-bFGF组的阳性面积比较高。(6)髓鞘分析。坚牢蓝染色后我们对再生神经的数量和直径进行了分析。在第6周和第12周，再生神经的数量和直径从LOCS+PBS组到LOCS+NAT-bFGF组再到LOCS+CBD-bFGF组出现递增的趋势，但是在第6周时，再生神经的数量和直径的差别没有统计学意义。通过透射电镜，我们分析了髓鞘厚度。LOCS+NAT-bFGF组的厚度比LOCS+PBS组高但比LOCS+CBD-bFGF组低。(7)肌肉重量检测和马松三色染色。与LOCS+NAT-bFGF组和LOCS+PBS组相比，LOCS+CBD-bFGF组的恢复率要比前两组高。但是腓肠肌恢复率在LOCS+NAT-bFGF组和LOCS+PBS组之间的差别无统计学意义。我们分析了肌肉阳性面积比例，LOCS+CBD-bFGF组、LOCS+NAT-bFGF组、LOCS+PBS组之间差别有统计学意义。肌肉阳性面积比在正常肌肉最高，在LOCS+PBS组最低。同时肌肉阳性面积比在LOCS+CBD-bFGF组要高于LOCS+NAT-bFGF组。
　　 结论：
　　 在本研究中，胶原管、有序胶原材料和基因工程改造的碱性成纤维细胞生长因子被联合应用并构建成一个生物功能材料，该功能材料各组分在大鼠坐骨神经5毫米缺损的横断伤模型中起到了协同作用。与NAT-bFGF相比，由于CBD-bFGF能与胶原结合在治疗部位形成了较高浓度，因此能更有效地促进神经再生和功能的恢复。该功能生物材料用于周围神经损伤的修复将是一个有效的策略。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 周围神经损伤概述

1．2 自体神经移植

1．3 神经导管的应用

1．4 细胞治疗

1．5 生长因子

第二章 胶原结合碱性成纤维细胞生长因子联合胶原支架促进坐骨神经横断伤修复研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

第三章 实验结果

3．1 制备的材料

3．2 大鼠造模和再生概况

3．3 坐骨神经功能指数

3．4 电生理测试

3．5 逆行示踪

3．6 形态和组织学观察

3．7 再生神经的髓鞘分析

3．8 腓肠肌恢复率和马松三色染色

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

缩写词简表

致谢

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