1-脱氧野尻霉素和脲酶对人工饲料育家蚕代谢的影响及消化酶基因表达研究

摘要

用人工饲料养蚕是今后养蚕业发展的重要方向，经过国内外蚕业界几十年的研究探索，家蚕人工饲料在营养配比、适口性等方面已取得很大进展，目前小蚕人工饲料育技术基本达到了生产实用化要求。但是全龄人工饲料养蚕依然存在着体质弱、抗性差、茧层率低等诸多问题未能解决，即使用高桑叶粉含量的人工饲料依然达不到桑叶养蚕的效果。现有研究表明，桑叶饲养的家蚕体内能富集对其他昆虫有害的生物碱1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin, DNJ），并且蚕体内DNJ含量存在规律性变化。另有研究发现，桑叶育的家蚕能够吸收桑叶中的脲酶，并能在血液中分解蚕体代谢产生的尿素，从而提高氮素的利用率，而人工饲料饲养的家蚕血液中没有脲酶，致使蚕体内和排泄物中尿素含量很高。为了探讨 DNJ和脲酶对家蚕的生理作用，本文利用代谢组学方法探讨了外源DNJ和脲酶对人工饲料育家蚕代谢的影响，并采用荧光定量PCR技术检测了人工饲料育家蚕中肠中4种消化酶基因的表达变化，以期为改良人工饲料配方提供参考。主要获得如下结果： 用人工饲料养蚕是今后养蚕业发展的重要方向，经过国内外蚕业界几十年的研究探索，家蚕人工饲料在营养配比、适口性等方面已取得很大进展，目前小蚕人工饲料育技术基本达到了生产实用化要求。但是全龄人工饲料养蚕依然存在着体质弱、抗性差、茧层率低等诸多问题未能解决，即使用高桑叶粉含量的人工饲料依然达不到桑叶养蚕的效果。现有研究表明，桑叶饲养的家蚕体内能富集对其他昆虫有害的生物碱1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin, DNJ），并且蚕体内DNJ含量存在规律性变化。另有研究发现，桑叶育的家蚕能够吸收桑叶中的脲酶，并能在血液中分解蚕体代谢产生的尿素，从而提高氮素的利用率，而人工饲料饲养的家蚕血液中没有脲酶，致使蚕体内和排泄物中尿素含量很高。为了探讨 DNJ和脲酶对家蚕的生理作用，本文利用代谢组学方法探讨了外源DNJ和脲酶对人工饲料育家蚕代谢的影响，并采用荧光定量PCR技术检测了人工饲料育家蚕中肠中4种消化酶基因的表达变化，以期为改良人工饲料配方提供参考。主要获得如下结果： 用人工饲料养蚕是今后养蚕业发展的重要方向，经过国内外蚕业界几十年的研究探索，家蚕人工饲料在营养配比、适口性等方面已取得很大进展，目前小蚕人工饲料育技术基本达到了生产实用化要求。但是全龄人工饲料养蚕依然存在着体质弱、抗性差、茧层率低等诸多问题未能解决，即使用高桑叶粉含量的人工饲料依然达不到桑叶养蚕的效果。现有研究表明，桑叶饲养的家蚕体内能富集对其他昆虫有害的生物碱1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin, DNJ），并且蚕体内DNJ含量存在规律性变化。另有研究发现，桑叶育的家蚕能够吸收桑叶中的脲酶，并能在血液中分解蚕体代谢产生的尿素，从而提高氮素的利用率，而人工饲料饲养的家蚕血液中没有脲酶，致使蚕体内和排泄物中尿素含量很高。为了探讨 DNJ和脲酶对家蚕的生理作用，本文利用代谢组学方法探讨了外源DNJ和脲酶对人工饲料育家蚕代谢的影响，并采用荧光定量PCR技术检测了人工饲料育家蚕中肠中4种消化酶基因的表达变化，以期为改良人工饲料配方提供参考。主要获得如下结果： 1. 用添加干物量0.1%DNJ的M10（桑叶粉含量10%）颗粒人工饲料全龄养蚕，于5龄3日测定血液中的DNJ含量表明，添食组的DNJ含量是对照组的6倍以上。颗粒饲料中添加 DNJ 对家蚕的体重生长有抑制作用，全茧量、茧层量和茧层率显著下降，但死笼率显著降低，虫蛹生命率显著提高。添食 DNJ 对家蚕中肠的蔗糖酶活力、血液海藻糖酶活力、血液海藻糖含量及脂肪体糖原含量有不同程度影响，但与对照差异不显著，说明DNJ不会影响家蚕的糖吸收和血糖浓度。 2. 采用GC-MS和LC-MS对家蚕5龄3日血液样品进行了代谢组学分析，在添食DNJ和不添食DNJ的人工饲料饲养育2组家蚕血液中共鉴定出130种代谢物质，其中DNJ添食组和对照组之间的差异代谢物质有23种，以有机酸和氨基酸居多。进一步对差异代谢物及其代谢通路分析表明，添食 DNJ 对蚕体的糖代谢、能量代谢和氨基酸代谢等均产生了不同程度的影响，其中受α-糖苷酶调控的糖代谢产物显著降低，?-呋喃果糖代谢产物显著升高，说明家蚕可通过呋喃果糖途径代谢糖类，以减轻 DNJ 的毒害。但家蚕周期性的积累与排泄DNJ的生理意义还有待进一步研究。 3. 在颗粒人工饲料中添加刀豆脲酶，可以被家蚕吸收，并在血液中保持活性。脲酶处理组的全茧量、茧层量和茧层率均不同程度高于对照组。另外，在熟蚕时，用不添食脲酶的人工饲料饲养的家蚕血液和蚕粪中的尿酸含量均显著低于添食和注射脲酶的家蚕，而蚕粪中尿素的含量极显著高于脲酶处理组。 4. 利用靶向代谢组学方法对血液中29种氨基酸及其代谢物分析表明，添食脲酶的人工饲料育熟蚕的血液中鸟氨酸的相对含量极显著高于对照组。在5龄5日注射脲酶的人工饲料育家蚕与对照蚕相比，熟蚕血液中的鸟氨酸和亚精胺的相对含量显著升高，组氨酸相对含量显著降低，其他物质的相对含量不存在显著差异。无论是添食还是注射脲酶，均导致鸟氨酸含量显著升高。推测可能是由于脲酶分解尿素，促进了精氨酸代谢，从而使鸟氨酸含量升高。 5. 利用靶向代谢组学方法对血液氨基酸及其代谢物分析结果还发现，人工饲料育家蚕无论是对照组还是添食或注射脲酶处理组，与桑叶育对照家蚕血液的氨基酸及其代谢物均存在较大差异。总体看来，人工饲料育家蚕血液中大多数游离氨基酸及其代谢物的相对含量高于桑叶育，其中人工饲料育对照组与桑叶育对照组差异代谢物最多。说明人工饲料育家蚕对氨基酸的利用率低于桑叶育，导致熟蚕期多种氨基酸及其代谢物在血液中积累，这可能是人工饲料育家蚕茧层量和茧层率低于桑叶育的重要原因。 6. 采用荧光定量PCR技术，测定了家蚕中肠中α-淀粉酶、麦芽糖酶、脂肪酶和类胰蛋白酶等4种消化酶基因在4龄和5龄期的表达变化，发现人工饲料育家蚕的各种消化酶基因表达量与桑叶育家蚕均存在较大差异，尤其是人工饲料育家蚕5龄期的脂肪酶和类胰蛋白酶基因的表达量极显著低于桑叶育家蚕，这可能是影响家蚕消化吸收、蚕体生长发育和抗病性的原因之一。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 家蚕的人工饲料与营养研究概况

1.2 1-脱氧野尻霉素研究进展

1.3 家蚕体内氮素排泄代谢与脲酶的作用

1.4 家蚕的消化酶及研究进展

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 数据统计分析

3 结果与分析

3.1 DNJ对人工饲料育家蚕生理和代谢的影响

3.2 脲酶对人工饲料育家蚕生理和代谢的影响

3.3 人工饲料育与桑叶育家蚕消化管中消化酶基因的表达差异

4 讨论

4.1 DNJ对家蚕代谢的影响及其生理作用

4.2 脲酶对人工饲料育家蚕氨基酸代谢的影响

4.3 人工饲料育家蚕消化酶基因表达的特点

5 结论

参考文献

致谢

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