嗜热真菌糖苷水解酶第七家族基因的克隆、表达及分子改造

摘要

纤维素作为一种含糖量最为丰富的可再生能源，在解决能源短缺方面具有重要的意义。研究发现纤维素酶降解纤维素是一种既环保又高效的方法。在纤维素降解过程中，酶活力高、热稳定性强的纤维素酶是提高酶解效率、减少成本的关键。 嗜热真菌产生的纤维素酶具有较高的酶活性及热稳定性。本研究分别将嗜热毁丝菌糖苷水解酶第七家族外切葡聚糖酶cbh1基因和嗜热毛壳菌糖苷水解酶第七家族内切葡聚糖酶eg2基因进行克隆、表达，获得外切葡聚糖酶CBH1和内切葡聚糖酶EG2。将纯化的蛋白CBH1和EG2进行SDS-PAGE电泳检测，CBH1的理论大小为54 kDa，而电泳结果显示蛋白的大小为72 kDa，推测蛋白可能存在糖基化修饰；EG2的电泳结果显示蛋白的大小为45 kDa，与理论值大小（45 kDa）相符。 为了获得具有更高活性的纤维素酶，提高纤维素酶对纤维素的降解效率，本研究分别对CBH1和EG2进行分子改造，期望可以获得具有更高酶活性及热稳定性的纤维素酶。根据同源建模的方法，分别对外切葡聚糖酶CBH1和内切葡聚糖酶EG2进行三维结构的预测。糖苷水解酶第七家族（GH7）外切葡聚糖酶（CBHs）在催化中心活性通道的顶端有一个环状结构，嗜热毁丝菌糖苷水解酶第七家族外切葡聚糖酶CBH1的环状结构由9个氨基酸组成，即G245-Y253，将该结构进行敲除，获得缺失突变体CBH1-DM；根据三维结构，选取CBH1底物结合平面内四个保守的芳香族氨基酸W38、W40、W372和W381以及EG2活性通道内，位于活性位点6 ?范围内的五个非保守氨基酸A141、L145、M195、I207和M342进行定点突变，获得CBH1的八个突变酶W38Y、W38F、W40Y、W40F、W372Y、W372F、W381Y和W381F以及EG2的四个突变酶A141S、L145T、M195L、I207V和M342F 。 将原酶和突变酶进行酶学性质的测定。实验结果表明，本研究已经成功获得两个酶活力提高的突变体，分别为CBH1-DM和W38Y。CBH1-DM的比活力为2.42 U/mg，是野生酶CBH1（1.17 U/mg）的2.1倍，突变酶W38Y的比活力为1.3 U/mg，是CBH1（1.17 U/mg）的1.1倍，剩余突变酶的酶活均有不同程度的降低；CBH1、CBH1-DM的最适温度均为50℃，剩余突变酶的最适温度为60℃；CBH1及突变酶的最适pH均为5.0；在70℃处理1小时后，CBH1仅剩余35%的酶活力，而CBH1-DM剩余65%的酶活力， CBH1-DM的热稳定性显著提高，而其他突变酶的热稳定性均有不同程度的降低。突变酶与野生酶EG2相比，酶活性均有不同程度的降低；EG2与突变酶最适温度均为50℃，最适pH均为5.0；与EG2相比，在80℃处理1小时后，EG2具有50%的酶活，而M195L具有65%的酶活，M195L的热稳定性提高，而其他突变酶的热稳定性均有不同程度的降低。

目录

声明

英文缩略词及中文对照表

1引言

1.1 纤维素的概述

1.2 纤维素酶的概述

1.3 嗜热真菌的概述

1.4 研究目的、内容及技术路线

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶cbh1基因的真核表达

2.3 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1的分子改造

2.4 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶eg2基因的真核表达

2.5 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2的分子改造

2.6 纯化蛋白性质的测定

3 结果与分析

3.1 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶cbh1基因的真核表达

3.2 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1突变基因的真核表达

3.3 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1及突变酶蛋白性质的测定结果分析

3.4 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶eg2基因的真核表达

3.5 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2突变基因的真核表达

3.6 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2及其突变酶蛋白性质的测定结果分析

4 讨论

4.1 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1及突变体酶学性质的研究

4.2 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2及突变体酶学性质的研究

5 结论

5.1 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1的克隆、表达及纯化

5.2 嗜热毁丝菌外切葡聚糖酶CBH1的分子改造

5.3 嗜热毛壳菌内切葡聚糖苷酶EG2的克隆、表达及纯化

5.4 嗜热毛壳菌内切葡聚糖酶EG2的分子改造

参考文献

致谢