死鸭胚中大肠杆菌的耐药与毒力基因分子流行病学调查

摘要

大肠杆菌是一种重要的食源性致病菌，具有广泛的宿主性，可导致人畜共患病，其成为危害养殖业发展最为严重的病原菌之一，尤其是大肠杆菌在种蛋孵化过程中能引起鸭胚的死亡，而且容易造成大面积感染，对养鸭业造成了严重的危害。 本论文为研究死亡鸭胚中病原菌的感染状况，以探究鸭胚在孵化过程中的死亡原因；通过药敏试验和耐药基因检测，初步掌握鸭胚源大肠杆菌耐药及耐药基因的携带情况；通过对鸭胚源大肠杆菌携带毒力基因的检测及ETT2毒力岛类型的分析，探讨鸭胚源大肠杆菌的致病性。 本研究共分五部分。 （1） 死亡鸭胚中细菌的分离鉴定 通过对无破损的死亡鸭胚进行细菌分离培养、染色镜检、16SrDNA 鉴定等方法，从415枚鸭胚中共分得细菌 370 株，分属27个种，其中 324 枚存在细菌感染，感染率为 78.1%。在分离的所有细菌中，大肠杆菌和沙门氏菌分别占33.2%和25.4%，是死亡鸭胚中的主要菌群。结果表明，造成种鸭孵化场胚胎死亡率和弱雏率明显升高的主要原因是细菌感染所致，并且大肠杆菌是主要的致病菌之一。 （2）鸭胚源大肠杆菌的耐药性调查 采用世界卫生组织（WHO）推荐的纸片法（Kirby-Baure 法）对123株鸭胚源大肠杆菌进行18种抗生素（氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物、β-内酰胺类药物等）的耐药性检测。结果显示，123株大肠杆菌对 18 种抗生素表现出不同程度的耐药：β-内酰胺类药物的耐药性最高，头孢氨苄耐药率为 82.9%，氨苄西林的耐药率为77.2%，头孢噻吩耐药率72.4%；喹诺酮类药物耐药率较高，环丙沙星为54.5%，诺氟沙星耐药率为49.6%，左氧氟沙星耐药率为 48%；氨基糖苷类药物耐药率较低，其中链霉素的耐药率最高为39.0%，其次是卡那霉素为30.9%，最低为庆大霉素，耐药率为10.6%；其他类药物中耐药率最低的为多粘菌素B，耐药率为13.8%。该项研究调查表明，在治疗和预防泰安地区种鸭孵化场致病性细菌感染时可以选择性配合使用氨基糖苷类药物和多粘菌素B。 （3） 鸭胚源大肠杆菌耐药基因的检测与鉴定 对鉴定的123株鸭胚源大肠杆菌进行氨基糖苷类钝化酶基因三重 PCR 检测，结果显示123株大肠杆菌中耐药基因ant(3’’)-Ia、aac(6’)-Ib和aph(3’)-IIa携带率分别为22.8%、3.3%和2.4%。16S 甲基化酶基因的PCR检测结果显示，123株鸭胚源大肠杆菌中耐药基因armA、rmtA和rmtB的携带率分别为95.1%、19.5%和0.8%。喹诺酮类耐药基因PCR检测结果表明，qnrD、qnrS、oqxA和oqxB的携带率分别为11.4%、22.0%、22.0%和15.4%，而qnrA、qnrB和qnrC未检出。β-内酰胺类耐药基因PCR检测结果显示，123株大肠杆菌中50株携带有TEM型β-内酰胺酶类耐药基因，基因携带率40.7%。 （4） 鸭胚源大肠杆菌毒力基因的检测与鉴定 对123 株鸭胚源大肠杆菌进行了18种毒力基因的多重 PCR 检测，分离强毒株42株，占比34.1%。其中yijp、fimC、iss、ibeB、ompA五种基因有非常高的检出率，此项调查为禽致病性大肠杆菌的长期监测和研究提供了理论依据。 本研究对123 株鸭胚源大肠杆菌进行了ETT2毒力岛的PCR检测，结果显示其中100株携带有ETT2毒力岛，检出率为 81.3%。123株鸭胚源大肠杆菌的ETT2毒力岛共分为A~K 11个类型，其中包括1个完整型和10个不同程度的缺失型。其中B型和C型的ETT2毒力岛检出率最高，检出率分别为31.7%(39株)和26.8%(33株)。此项试验对ETT2毒力岛在鸭胚源大肠杆菌的分布情况进行调查，为进一步研究 ETT2毒力岛在鸭胚源大肠杆菌中的致病机制奠定基础。

目录

声明

符号说明

1 前 言

1.1 大肠杆菌

1.2大肠杆菌的检测方法

1.3大肠杆菌的耐药性

1.4大肠杆菌毒力因子

1.5 毒力岛

1.6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2方法

3结果

3.1死亡鸭胚中细菌的分离鉴定结果

3.2 鸭胚源大肠杆菌药敏试验结果

3.3 鸭胚源大肠杆菌耐药基因检测与鉴定结果

3.4 鸭源大肠杆菌毒力基因检测与鉴定结果

3.5鸭源大肠杆菌ETT2毒力岛类型分析结果

4讨论

4.1 死亡鸭胚中细菌的流行状况

4.2 鸭胚源大肠杆菌药敏试验检测

4.3 鸭源大肠杆菌耐药基因检测

4.4 鸭源大肠杆菌毒力基因检测

4.5鸭源大肠杆菌ETT2毒力岛类型分析

5结论

参考文献

致谢