山东省辣椒病毒病病原的检测鉴定及BWYV和CABYV的序列分析

摘要

辣椒是一种重要的蔬菜，山东省是我国重要的辣椒产区之一。近年来，辣椒种植面积逐年增加，病毒病发生日益严重，辣椒产量和品质均受到影响，造成重大的经济损失，制约辣椒产业的发展。 为了进一步明确侵染山东省辣（甜）椒的病毒种类以及病毒的发生分布情况，本研究运用分子生物学方法，利用14种病毒的特异性引物对采自山东省济宁、潍坊、聊城、泰安、烟台、德州和淄博等7个地区的542份辣（甜）椒样品进行病毒的检测与鉴定，并对甜菜西方黄化病毒（Beet western yellows virus,BWYV）和南瓜蚜传黄化病毒（Cucurbitaphid-borne yellows virus,CABYV）的全基因组序列进行克隆测序及分析。分别将这两种病毒的全基因组序列与相应的病毒序列进行比对，并分别对其全基因组核苷酸序列进行了相似性分析和系统进化分析，利用RDP4软件对BWYV和CABYV分离物进行RNA重组分析。 主要研究结果如下： 1.2016-2017年，对542份辣（甜）椒样品进行14种病毒检测，共检测出5种病毒，分别是BWYV、CABYV、辣椒脉黄化病毒（Pepper vein yellows virus,PeVYV）、辣椒潜隐病毒1（Pepper cryptic virus1,PCV-1）和辣椒潜隐病毒2（Pepper cryptic virus2,PCV-2）。其中甜瓜蚜传黄化病毒（Melon aphid-borne yellows virus,MABYV）、番茄斑萎病毒（Tomatospot wilt virus,TSWV）、南方番茄病毒（Southern tomato virus,STV）、辣椒环斑病毒（Chilli ring spot virus,ChiRSV）、番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）、葫芦蚜传黄化病毒（Pepo aphid-borne yellows virus,PABYV）、丝瓜蚜传黄化病毒（Suakwa aphid-borne yellows virus,SABYV）、花生矮化病毒（Peanut stunt virus,PSV）和番茄坏死矮化病毒（Tomato necrotic stunt virus,ToNStV）未检测到。2016-2017年，病毒检出率为63.65%，其中2016年病毒检出率为64.18%，2017年病毒检出率为60.92%。在检出的病毒中，PCV-1病毒检出率最高，达32.84%，其次是PCV-2、BWYV和PeVYV，检出率分别是31.73%、31.32%、7.75%，CABYV检出率最低为0.37%。 2.在检测的542份样品中，存在病毒的复合侵染现象，病毒的复合侵染率为31.30%。主要存在2种和3种病毒的复合侵染类型，其中以2种病毒的复合侵染类型为主，复合侵染率为92.59%，3种病毒复合侵染率为7.41%。 3.分别从济宁和潍坊两地在2016年和2017年采集的感染BWYV的辣椒样品中各选取一个进行BWYV全基因组序列扩增，得到4条BWYV的全基因组序列，长为5693-5699bp。对CABYV进行全基因组序列扩增，结果显示CABYV的全基因组序列长为5684bp。 4.分别对BWYV和CABYV的全基因组核苷酸序列进行相似性分析和系统进化树分析，结果表明：4个BWYV山东分离物聚类在一个分支上，与中国和韩国分离物聚类在一个分支上，亲缘关系较近。BWYV在进化上可能与地理位置有关，与寄主无明显关系。CABYV-LJ3与中国、韩国和日本分离物聚类在一个分支上，亲缘关系较近，该病毒在进化上可能与地理位置有关，与寄主无关。分别对BWYV和CABYV进行重组分析，结果表明：BWYV-JN16311与BWYV-WF1793分离物之间存在重组现象。CABYV-LJ3分离物与中国分离物（GQ221223）存在重组现象，与中国分离物（HQ439023）存在潜在重组。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 辣椒病毒病简介

1.1.1 马铃薯卷叶病毒属

1.1.2 δ双分病毒属

1.2 辣椒病毒病的检测技术研究概况

1.2.1 生物学检测法

1.2.2 电镜检测法

1.2.3 血清学检测法

1.2.4 分子生物学检测法

1.3 辣椒病毒病的防治措施

1.3.1 选育抗耐病品种

1.3.2 农业防治

1.3.3 物理防治

1.3.4 化学防治

1.4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 病毒样品的采集

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 实验试剂的配制方法

2.2 辣椒样品中RNA病毒的检测与鉴定

2.2.1 样品RNA的提取

2.2.2 相关引物的设计与合成

2.2.3 反转录

2.2.4 PCR扩增

2.2.5 PCR产物的克隆及测序

2.2.6 序列分析

2.3 BWYV和CABYV全基因组序列扩增

2.3.1 感病植株RNA的提取

2.3.2 引物的设计及合成

2.3.3 反转录

2.3.4 BWYV、CABYV全基因组PCR的扩增

2.3.5 PCR产物的克隆及测序

2.3.6 序列分析

2.4.2 引物的设计及合成

2.4.3 cDNA的合成及加d（G）尾

2.4.4 巢式PCR扩增

2.4.5 PCR产物的克隆及测序

2.4.6 序列分析

2.5 BWYV和CABYV的3'RACE扩增

2.5.1 感病植株RNA的提取

2.5.2 引物的设计及合成

2.5.3 加d（A）尾及反转录

2.5.4 巢式PCR扩增

2.5.5 PCR产物的克隆及测序

2.5.6 序列分析

3 结果与分析

3.1 山东省辣椒病毒病的病原检测情况

3.1.1 2016-2017年山东省侵染辣椒的病毒检出率

3.1.2 山东省辣椒病毒病病毒复合侵染情况

3.2 BWYV的全基因组序列扩增及分析

3.2.1 BWYV的全基因组序列扩增

3.2.2 BWYV的全基因组结构分析

3.2.3 BWYV的全基因组核苷酸系统进化分析

3.2.4 BWYV的重组分析

3.3 CABYV的全基因组序列扩增及分析

3.3.1 CABYV的全基因组序列扩增

3.3.2 CABYV的全基因组结构分析

3.3.3 CABYV的全基因组核苷酸系统进化分析

3.3.4 CABYV的重组分析

4 讨论

4.1 侵染山东省辣椒的病毒种类鉴定

4.2 BWYV全基因序列分析

4.3 CABYV全基因序列分析

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文