犬λ-干扰素在昆虫杆状病毒中的表达及其生物活性研究

摘要

干扰素（Interferon, IFN）是在特定的诱生剂刺激下，由单核细胞和淋巴细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白，在同种细胞中具备光谱的抗病毒、抗肿瘤以及免疫调控等生物学功能。在早期免疫反应中扮演重要作用，是抵抗病毒感染的第一道屏障。干扰素并不能直接作用于病毒，而是通过与靶细胞膜受体结合的方式发挥生物学作用。根据结合膜受体的不同，可将干扰素分为三个类型，分别为I型、II型和III型。I型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-ω等亚型，II型干扰素只有IFN-γ一种亚型。IFN-λ是2003年从脊椎动物中鉴定出的分类为Ⅲ型干扰素的家族成员, 由IFN-λ1, IFN-λ2和IFN-λ3组成，也称作IL29, IL28A和IL28B。其中I型（如IFNα）长期作为抗病毒和抗肿瘤药物应用在人医临床，目前也已有少量I型干扰素应用于兽医临床并具有很好的治疗效果，III型干扰素与I型干扰素相类似，同样具有在兽医临床中用作抗病毒和抗肿瘤药物的潜力。由于III型干扰素受体仅局限表达于上皮细胞和某些树突状细胞亚群，因此III型干扰素的作用有组织特异性，相应的毒副作用小。在之前的研究中，IFN-λ主要通过大肠杆菌等原核表达系统表达，具有产量低，难以纯化，成本高，活性差等缺点。相较于原核表达系统, 真核表达系统表达的干扰素具有产品质量稳定、纯度高、质量易于控制、便于规模化生产等优点，并且大规模生产使其成本大大降低,有利于其在现代宠物行业中的推广与使用。目前，I型和II型干扰素已被广泛应用于多种疾病的治疗，而III型干扰素（IFN-λ）的研究还相对滞后，目前对犬类干扰素的研究还不是很全面，国内尚无体外表达的犬IFN-λ用于临床的报道。本研究拟利用昆虫杆状病毒表达系统对犬IFN-λ进行体外表达并纯化，并深入研究重组蛋白的抗病毒活性，为新型抗病毒药物的研发奠定基础。 为了大量获得在结构和功能等方面更接近天然，并且具有一定临床应用价值的犬重组IFN-λ。本研究构建了表达犬IFN-λ的重组质粒并产生合适滴度的重组杆状病毒，通过优化表达条件，利用昆虫杆状病毒表达系统获得一定量的活性较高的重组犬IFN-λ，并对重组蛋白的抗病毒活性进行初步体外抗病毒实验。为今后更深层次的临床研究打下了坚实的理论基础,为新型有效的动物抗病毒药物的研发以及高效的基因工程干扰素制品的构建提供了研究手段和理论依据。本课题首先根据NCBI上收录的犬IFN-λ的基因序列，设计含有EcoR I和Sal I酶切位点的上下游引物，通过PCR扩增犬IFN-λ基因，利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有CaIFN-λ基因完整ORF的杆状病毒表达供体质粒，将供体质粒转化至DH10Bac感受态细胞中，通过蓝白斑筛选提取重组杆状病毒穿梭质粒，将重组质粒转染到昆虫细胞中获得P1代重组杆状病毒rBAC-CaIFN-λ，将病毒按照合适的比例感染昆虫细胞，表达犬IFN-λ重组蛋白。通过Western Blot和间接IFA验证犬重组IFN-λ在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得表达，表达蛋白的分子质量均在24KD左右。通过反复冻融细胞使蛋白分泌到培养基上清中，利用His柱亲和层析的原理通过蛋白纯化仪纯化重组蛋白，并对纯化后的蛋白进行初步的抗病毒活性研究。实时荧光定量PCR以及细胞病变抑制试验的结果表明该犬IFN-λ能够诱导干扰素下游基因ISG15、Mx1和OAS的表达，并且能够在MDCK细胞上抑制VSV-GFP的复制。 综上所述，本课题通过昆虫杆状病毒表达系统表达的犬IFN-λ具有一定的抗病毒活性，表明了该重组蛋白具有防治病毒性疾病的潜力，为今后将犬IFN-λ开发为新型有效的动物抗病毒药物奠定基础。

目录

声明

符 号 说 明

1.干扰素（IFN）概述

1.1 干扰素的分类及其受体分布

1.2 IFN-λ的空间结构

1.3模式识别受体及其介导的信号通路

1.4 JAK-STAT信号通路

1.5干扰素诱导基因

1.6干扰素的免疫调节

1.7昆虫杆状病毒表达系统

1.8国内外研究现状分析

1.9研究内容及方法

1.10研究的目的及意义

2实验材料及方法

2.1 主要仪器设备

2.2质粒、受体菌、细胞系

2.3实验试剂

2.4主要试剂配制

2.5 引物

2.6 重组杆状病毒供体质粒的构建

2.7转座及蓝/白斑筛选

2.8 重组穿梭质粒的无内毒素提取及鉴定

2.9 重组穿梭质粒的鉴定

2.10转染

2.11 重组杆状病毒DNA的提取与鉴定

2.12重组杆状病毒的繁殖及病毒滴度测定

2.13IFA检测重组蛋白的表达

2.14 重组蛋白在昆虫细胞中的表达检测

2.15蛋白纯化

2.16 实时荧光定量PCR（qPCR）

2.17重组干扰素的体外活性检测

3实验结果与分析

3.1 犬IFN-λ基因的PCR扩增

3.2重组供体质粒 pFast-IFN-λ的构建以及鉴定

3.3重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-IFN-λ的的提取和鉴定

3.4重组杆状病毒rBac-IFN-λ的PCR鉴定

3.5扩增重组杆状病毒

3.6间接免疫荧光以及免疫印迹检测CaIFN-γ的表达

3.7蛋白纯化及SDS-Page验证

3.8犬λ干扰素刺激MDCK细胞对干扰素诱导基因的影响

3.9犬λ干扰素的抗病毒活性测定

4讨论

5结论

参考文献

致谢