重组禽β-防御素2和6协同抗禽肿瘤病毒感染研究

摘要

近年来，随着我国养禽业的迅速发展，规模扩大化，集约化、高密度的饲养方式成为普遍的饲养模式，这也造成了肿瘤性免疫抑制疫病的大规模爆发，比如 REV、MDV、ALV-J等。禽肿瘤病病毒(ALV-J、REV、MDV)会引起种鸡、肉鸡、蛋鸡等各个品系鸡群肿瘤相关性疾病，长期给我国养禽业带来巨大的危害和经济损失。禽肿瘤病的流行严重影响到我国养禽业的发展。而针对该类型的流行病目前尚无非常有效的治疗和免疫的方法，因此，开发抗禽肿瘤病毒的无毒、无副作用的新型生物药物非常必要。 禽β-防御素是一类内源性阳离子抗菌肽，富含半胱氨酸，分子内由保守的6个半胱氨酸残基组成3对稳定的二硫键。禽β-防御素在禽类免疫系统中起着十分重要的作用，是抵抗外界病原微生物入侵机体的重要保护膜，具有广谱抗真菌、抗菌、抗病毒的生物学作用。 为研究鸡 AvBD抗禽肿瘤病病毒的作用，根据鸡 AvBD的同源性、体内组织分布情况等特点，从14种鸡 AvBD中选择了鸡 AvBD2和鸡 AvBD6进行抗禽肿瘤病病毒的研究。使用PCR的方法，从SPF鸡的睾丸和肝脏组织中分别扩增到鸡AvBD2和AvBD6基因。将两种AvBD克隆到表达载体pGEX-6p-1上，构建重组表达质粒pGEX-AvBD，把重组质粒转化到表达菌DH5α中，通过IPTG诱导表达AvBD2和AvBD6的融合蛋白，表达产物以包涵体的形式存在。将表达的重组蛋白纯化复性后成功得到了具有天然生物活性的鸡AvBD2和AvBD6。对接种病毒(ALV-J、MDV、REV)的CEF细胞再分别加入不同浓度的AvBD2和AvBD6以及两种蛋白的混合。通过实时荧光定量 PCR、Western blot分别检测各试验组中病毒转录水平和蛋白水平，发现 AvBD2和 AvBD6均对 ALV-J、MDV、REV病毒有抑制作用，随着加入蛋白浓度的增加抑制效果加强，并且两种禽β-防御素协同性抑制了ALV-J、MDV、REV病毒的复制。选择AvBD抑制效果最明显的 ALV-J病毒，进行动物体内的抗病毒感染试验，试验组共分为7组：ALV-J、AvBD2+ALV-J 、 AvBD6+ALV-J 、 AvBD2+AvBD6+ALV-J 、 AvBD2 、 AvBD6 、AvBD2+AvBD6。即前4组都为接ALV-J组，其中3组再分别接入相应的蛋白，后3组为接蛋白组，只接入蛋白。对已攻毒成功的 SPF雏鸡接种 AvBD2和 AvBD6以及混合的两种 AvBD蛋白，未攻毒的 SPF雏鸡也接种相应组别的 AvBD蛋白进行对照，连续接种两次后剖杀，从大体器官、组织病理学、血液学来进行试验分析。剖检后观察到4 个攻毒组的肝脏、心脏、脾脏和肺脏发育大小均不如非攻毒组，而且4个攻毒中， ALV-J组与其他 ALV-J+AvBD组相比，肝脏、心脏、肺脏、脾脏等主要器官发育较小。通过组织病理学观察发现，在4组接ALV-J组中，肝脏出现淋巴细胞炎性灶；肺脏出现淋巴细胞炎性灶，弥漫性充血；肾脏肾小管上皮细胞空泡变性，弥漫性充血，淋巴细胞浸润；胸腺弥漫性充血，淋巴细胞大量流失；脾脏弥漫性充血。其中 ALV-J组病变情况最为严重，而3组 AvBD+ALV-J组中各器官的病变情况次之，ALV-J+AvBD2+AvBD6组器官病变情况最轻微。从血涂片观察到4个攻毒组血液中异嗜性粒细胞数量增多，淋巴细胞增多，4个攻毒中，3个 ALV-J+AvBD组血液中异嗜性粒细胞和淋巴细胞数量比ALV-J组要少。从上述的体内试验可得出，AvBD2和AvBD6在鸡体内可以抑制ALV-J病毒，具有抵抗感染效果，并且具有协同抗感染作用。 本研究运用pGEX-6P-1载体，DH5α表达菌成功建立鸡AvBD2和AvBD6的体外原核表达方法。并通过实时荧光定量PCR，Western blot等方法对鸡AvBD2和AvBD6体外协同抗禽肿瘤病病毒(ALV-J、REV、MDV)进行研究。通过大体剖检器官观察，病理组织学，血液学等方法对鸡AvBD2和AvBD6体内协同抗ALV-J进行研究。以上研究对禽β-防御素在体外表达、研发抗禽肿瘤病病毒生物药物以及抗囊膜病毒机制等研究上奠定一定的基础。

目录

声明

符号说明

1前 言

1.1 防御素的研究进展

1.2禽β-防御素（AvBD）的研究进展

1.3禽肿瘤病病毒研究现状

1.4本研究目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.2 AvBD2和AvBD6基因的克隆与序列分析

2.3重组AvBD2和重组AvBD6的原核表达

2.4重组AvBD2和重组AvBD6蛋白体外抗禽肿瘤病病毒

2.5重组AvBD2和重组AvBD6蛋白体内抗ALV-J病毒

3实验结果与分析

3.1鸡AvBD2、AvBD6基因获取与分析

3.2 鸡AvBD2、AvBD6原核表达载体构建

3.3 鸡AvBD2、AvBD6基因在大肠杆菌中的诱导表达

3.4 AvBD2、AvBD6蛋白体外抗禽肿瘤病毒

3.5 AvBD2、AvBD6蛋白体内抗ALV-J感染

4讨论

5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况