禽β-防御素7和10抗三种病毒感染研究

摘要

J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）、马立克氏病病毒（Marek's disease virus,MDV）、猪圆环病毒病毒2型（Porcine circovirus2,PCV2）这三种病毒都可以引起被感染动物免疫抑制，造成动物机体免疫力下降，从而利于其它病原菌的入侵，引起两种或多种疾病的并发感染，增加了诊断和治疗的难度。目前MDV与PCV2主要通过接种疫苗来进行防控，虽然在一定程度上减少了疾病的发生，但同时也加剧了毒株的变异速度。ALV-J主要通过淘汰方式来进行净化，但2018年中国几个省份几乎同时爆发由ALV-J引起的髓细胞瘤病，使得ALV-J的净化之路愈发艰巨。而抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生态平衡，药物残留也影响了畜产品的品质和人类健康。因此，急需开发出一种无毒副作用又不会使病原菌产生耐药性的药物来解决这一问题。防御素具广谱抗微生物活性，能有效地杀灭病毒、细菌、真菌、螺旋体等病原微生物，对肿瘤细胞也有细胞毒作用，且迄今尚未发现有致病菌株对其产生耐药性。许多证据表明，防御素对囊膜病毒有显著抑制作用。β-防御素是禽类中唯一的防御素，目前已经发现的禽β-防御素已经超过25种，而鸡β-防御素有14种。鸡β-防御素在鸡体内分布十分广泛，几乎存在于鸡的各个组织器官中。为研究鸡β-防御素的抗病毒作用，本研究根据鸡β-防御素在鸡体内分布情况以及其特性等从14种鸡β-防御素中挑选鸡β-防御素7（AvBD7）、鸡β-防御素10（AvBD10）进行抗ALV-J、MDV、PCV2作用研究。 本研究采用基因克隆的方法，分别从鸡的肝脏、睾丸组织中扩增得到AvBD7、AvBD10基因，将两种基因亚克隆到表达载体pET-32a上，构建重组质粒，将重组质粒转化至BL21表达菌中，用IPTG进行诱导表达，超声破碎诱导后菌体，并离心取上清和沉淀进行检测。结果表明，在破碎菌体的上清和沉淀中均有目的蛋白表达。用镍柱法对表达的重组蛋白进行纯化得到AvBD7、AvBD10蛋白。首先在体外验证这两种蛋白的抗病毒作用，具体方法为：培养DF-1/PK-15细胞，接种ALV-J、MDV和PCV2，确定细胞感染病毒后，接入适宜浓度的AvBD7、AvBD10蛋白，培养一段时间后，qPCR和western blot检测不同试验组病毒载量和蛋白表达量的变化。结果发现，AvBD7、AvBD10蛋白对MDV有较好的抑制效果，而对ALV-J和PCV2的抑制效果不明显。为进一步验证AvBD7、AvBD10蛋白的抗MDV作用，本试验设计并进行了体内试验，体内试验共分为6个组，分别为MDV、MDV+AvBD7、MDV+AvBD10、AvBD7、AvBD10以及Normal，其中Normal组接入与防御素蛋白同等剂量的咪唑。前三个组在雏鸡3日龄时接种MDV，后三组不做处理。确定接毒成功后，根据组别分别注射相应的蛋白和咪唑。最后统一剖杀处理，分别从大体剖检病变观察、血液学观察以及组织病理学观察对不同组别进行症状分析。大体剖检病变结果显示MDV感染组鸡的脾脏、胸腺、法氏囊有一定程度的萎缩，腺胃有轻度的纤维素性渗出，肝脏可见白色点状灶，其它组织器官则相对正常；另外三组没有出现明显的眼观病变。血液学观察结果显示病毒感染组血液中炎性细胞数量增多，主要是淋巴细胞增多，两个防御素治疗组的血液中，也有少量炎性细胞存在。组织病理学观察结果显示3个感染MDV组鸡的肝脏中均有炎性灶出现，而且MDV组最严重；MDV感染组腺胃的腺管间出现炎性细胞浸润，另外几组炎症反应较轻微；MDV感染组的肾脏有大的炎性灶，MDV+AvBD7和MDV+AvBD7组的肾脏肾小管上皮细胞轻度空泡变性。综上所述，体内注射AvBD7/AvBD10能够减轻MDV感染所造成的病理损伤。 本研究运用原核表达载体pET-32a成功建立AvBD7、AvBD10体外表达方法。体外试验探索AvBD7、AvBD10对三种引起免疫抑制的病毒（ALV-J、MDV、PCV2）的抵抗作用，体内试验探索对MDV的抵抗作用。本研究结果丰富了对鸡β-防御素功能的认识，为开发新型抗病毒类药物提供了理论依据。

目录

声明

符号说明

1前 言

1.1 抗菌肽简介

1.1.1 抗菌肽的定义

1.1.2 抗菌肽的分类

1.2 抗菌肽家族成员-防御素简介

1.2.1 防御素的定义

1.2.2 防御素的分类

1.2.3 防御素的生物学作用及机制

1.3 禽β-防御素的研究进展

1.3.1禽β-防御素的结构特征及生物学特性

1.3.2 禽β-防御素的研究展望

1.4 ALV-J、MDV、PCV2简介

1.4.1 ALV-J的病原学与致病性

1.4.2 MDV的病原学与致病性

1.4.3 PCV2的病原学与致病性

1.5 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 病毒、载体、菌种、细胞和试验动物

2.1.2 试验试剂

2.1.3 主要试剂的配制

2.1.4 主要试验仪器

2.2 试验方法

2.2.1 AvBD10目的基因的获取

2.2.2 重组AvBD7和AvBD10的原核表达

2.2.3 AvBD7蛋白和AvBD10蛋白的纯化与检验

2.2.4 重组AvBD7和AvBD10蛋白的体外抗病毒试验

2.2.5 AvBD7和AvBD10蛋白体内抗MDV试验

3 结果与分析

3.1 目的基因的获取

3.1.1 设计引物提取目的基因

3.1.2 重组质粒鉴定及序列对比

3.2 AvBD7和AvBD10蛋白原核表达

3.2.1 原核表达载体构建

3.2.2 AvBD7和AvBD10蛋白的诱导表达

3.2.3 纯化AvBD7和AvBD10蛋白的浓度测定

3.2.4 纯化AvBD7和AvBD10蛋白的SDS-PAGE和western blot检测

3.3 AvBD7和AvBD10蛋白体外抗病毒试验

3.3.1 AvBD7和AvBD10蛋白对细胞的毒性检测

3.3.2 qPCR检测AvBD7和AvBD10蛋白体外抗病毒效果

3.3.3 Western blot检测AvBD7和AvBD10蛋白体外抗病毒效果

3.4 AvBD7和AvBD10蛋白体内抗MDV感染试验

3.4.1大体剖检病变观察

3.4.2 血涂片观察

3.4.3 组织病理学观察

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况