苹果SUMO E3连接酶MdSIZ1响应逆境调控PM H+-ATPase酶活性和花青苷积累

摘要

高等植物在生长发育过程中经常遭受各种逆境的胁迫。为了增强对不利环境的适应，植物在长期的进化过程中形成了一系列机制来精细调控对逆境的响应。质膜是植物细胞与外界环境之间进行物质与信息传递的主要部位，也是植物感受各种逆境胁迫信号的最初感应部位。质膜H+-ATPase（PM H+-ATPase）作为质子泵，是含量最多的质膜蛋白，参与植物对多种逆境胁迫的响应。PM H+-ATPase在质膜两侧建立跨膜质子电动势，水解ATP产生能量，驱动离子或溶质的主动运输，在植物养分吸收，生长发育和逆境应答等方面发挥着不可或缺的作用。但是对于植物调控PM H+-ATPase活性的机理，目前的研究仍不充分。 蛋白的翻译后修饰在植物快速响应外界环境信号，调控蛋白的稳定和功能中具有重要作用。小泛素类似修饰物SUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）与靶蛋白特定位点的结合是一种重要的蛋白翻译后修饰方式。在蛋白的SUMO化修饰过程中，SUMO蛋白首先被SUMO E1激活酶催化激活，随后被转移到SUMO E2结合酶上，SUMO E3连接酶则结合到E2上组成蛋白复合体，催化SUMO蛋白与靶蛋白特定位点的结合，最终完成SUMO化修饰。在植物中，SUMO E3连接酶SIZ1介导的SUMO化修饰被证明广泛参与调控了植物的生长发育以及对各种逆境胁迫的响应过程。然而，SIZ1与植物PM H+-ATPase活性调节和花青苷代谢调控之间的关系以及其上游调控网络，目前还不清楚。 铁元素在地壳中的含量仅次于氧、硅和铝，位居第四，然而，由于铁独特的化学性质，其在中性及碱性土壤中大多以难以被植物吸收利用的氢氧化物的形式存在，缺铁在植物中仍然普遍存在。为了适应缺铁环境，植物进化出了许多机制来精细调控铁吸收过程，其中，PM H+-ATP酶介导的质子外泌，酸化根际以增加铁的溶解度是双子叶及非禾本科单子叶植物提高铁吸收效率的第一步，具有重要作用。在植物中，许多转录因子已经被证明可以调控PM H+-ATP酶编码基因的转录水平，进而影响PM H+-ATP酶的活性。MdbHLH104是苹果铁吸收动态平衡的正调控因子，可以直接结合在PM H+-ATP酶基因MdAHA8的启动子上，转录激活其表达，促进苹果根系在缺铁条件下的质子外泌，增加铁吸收。已经证明，BTB-TAZ蛋白MdBT2可以响应铁离子浓度的变化，在富铁条件下富集，通过泛素化降解MdbHLH104的方式抑制苹果对铁离子的吸收。然而，MdbHLH104在蛋白水平上的正调控因子，至今仍没有报道。 花青苷是植物的次生代谢产物，是重要的天然植物色素。在苹果中，花青苷决定了果实的红色色泽，对苹果的商品价值具有重要影响。在植物中，花青苷由苯丙氨酸开始，经过一系列催化步骤，最终形成。已经证明，由MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白组成的MBW蛋白复合体对花青苷代谢途径结构基因的转录调控是植物花青苷代谢调控的主要方式。在苹果中，MBW蛋白复合体由MdMYB1、MdbHLH3和MdTTG1组成。光照、温度、营养元素等外界环境因子可以通过对MBW蛋白复合体组分的影响，调控花青苷在苹果中的积累。在生产上，适度低温逆境可以促进苹果花青苷的生物合成和果实着色，然而，关于苹果如何对适度低温逆境做出响应，进而促进花青苷形成的机理，研究尚不深入。 本研究以苹果苗、愈伤组织和拟南芥为材料，利用分子生物学的研究方法，在苹果响应铁匮缺和适度低温逆境，调控PM H+-ATPase活性和花青苷积累的机制研究方面取得以下结果： 1、SUMO E3连接酶MdSIZ1的转录水平和蛋白丰度，以及MdSIZ1介导的苹果总SUMO化均被缺铁处理显著诱导。借助发根农杆菌介导的根系基因沉默技术，我们发现MdSIZ1的沉默严重抑制了苹果根系PM H+-ATPase活性和铁吸收过程，暗示其在调控苹果PM H+-ATPase活性中发挥了重要作用。在拟南芥中异位表达MdSIZ1则明显促进了拟南芥幼苗的根际酸化和铁吸收，说明MdSIZ1是植物PM H+-ATPase介导的铁吸收过程的正调控因子。 2、利用酵母双杂交筛库实验，我们筛选到了MdSIZ1的直接靶蛋白MdbHLH104。MdSIZ1与MdbHLH104在体外和体内条件下均直接互作。进一步实验证实，MdSIZ1与MdbHLH104的互作是特异性的，MdSIZ1不与和MdbHLH104形成同源或异源二聚体的其他IVc类bHLH转录因子互作。 3、体内和体外SUMO实验证实，MdSIZ1在缺铁条件下将MdbHLH104直接SUMO化。进一步研究发现，MdbHLH104氨基酸序列上第139位和第153位赖氨酸残基是关键的SUMO化位点，单独突变其中的任何一个均不能有效抑制MdbHLH104的SUMO化，将二者同时突变则可以完全封闭MdSIZ1对MdbHLH104的SUMO化。 4、体内蛋白降解实验发现，MdbHLH104的SUMO化修饰促进了其蛋白稳定性。MdbHLH104SUMO化位点的突变导致MdbHLH104蛋白迅速水解，而MdSIZ1的过量表达则可以抑制MdbHLH104蛋白的水解。进一步研究发现，MdbHLH104的SUMO化抑制了泛素分子对其结合，进而抑制MdbHLH104蛋白通过泛素/26S蛋白酶体途径降解。 5、EMSA实验证明，MdbHLH104SUMO化位点的突变抑制了其对下游MdAHA8基因启动子的绑定能力。进一步分析表明，MdbHLH104的SUMO化影响了其对MdAHA8基因的转录激活。 6、借助病毒载体瞬时沉默技术，我们发现MdSIZ1促进缺铁条件下苹果质子外泌与铁吸收是部分依赖MdbHLH104的。除MdAHA8外，MdSIZ1同时上调了MdAHA1和MdAHA9的表达，暗示MdSIZ1可能通过对MdAHA1和MdAHA9上游未知转录因子的SUMO化修饰，调控了它们的转录。 7、qRT-PCR分析表明，除缺铁逆境外，MdSIZ1同时被17℃适度低温逆境诱导。MdSIZ1在17℃条件下将花青苷代谢相关的MBW蛋白复合体中的MdMYB1转录因子SUMO化修饰，增强其蛋白稳定性，进而促进适度低温条件下苹果花青苷的积累。 8、启动子分析表明，MdSIZ1启动子上的LTR和MBS顺式作用元件均可对17℃适度低温做出响应，其中MBS顺式作用元件起主要作用。 9、借助酵母单杂交、EMSA和Chip实验，我们发现MdMYB2可以直接结合在MdSIZ1启动子的MBS结合元件上，转录激活MdSIZ1的表达，影响其对MdMYB1蛋白的SUMO化修饰，最终调控了17℃适度低温条件下花青苷在苹果中的积累。 本研究找到了一个响应铁匮缺和适度低温逆境的关键调控因子MdSIZ1，并阐述了“缺铁-MdSIZ1-MdbHLH104-MdAHA8”和“适度低温-MdMYB2-MdSIZ1-MdMYB1”的调控网络。MdSIZ1通过对苹果PM H+-ATPase活性和花青苷生物合成途径的影响，在调控苹果对包括缺铁在内的多种逆境胁迫的响应和养分吸收以及花青苷生物合成和果实着色过程中发挥了重要作用，为苹果优良砧木的筛选奠定了理论基础。 本研究取得的结果对于拓展人们对植物，特别是多年生木本果树响应外界逆境环境，维持自身正常的生理代谢过程机制的认识，具有重要理论指导意义。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1质膜型氢离子ATP酶（PM H+-ATPase）

1.1.1 PM H+-ATPase的结构

1.1.2 PM H+-ATPase的生理功能

1.1.3 PM H+-ATPase与营养元素

1.1.4 PM H+-ATPase的翻译后调控

1.1.5 PM H+-ATPase的转录调控

1.2铁素营养与植物

1.2.1铁元素对植物的重要性

1.2.2高等植物铁吸收机制

1.2.3植物铁吸收及转运相关基因

1.3植物缺铁响应调控

1.3.1植物感应缺铁的信号物质

1.3.2植物缺铁响应的转录调控

1.3.3植物缺铁响应转录因子的调控

1.4 花青苷与植物

1.4.1 花青苷在植物中的代谢

1.4.2 花青苷代谢相关基因

1.4.3 花青苷代谢途径调控

1.4.4 环境因子对植物花青苷代谢的影响

1.5蛋白的SUMO化修饰

1.5.1 SUMO化过程研究进展

1.5.2 SUMO化在植物中的功能

1.6研究目的及意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株

2.1.3载体

2.1.4酶和生化试剂

2.1.5引物

2.1.6培养基

2.1.7抗生素

2.1.8溶液与缓冲液

2.2实验方法

2.2.1 植物总RNA提取

2.2.2 cDNA反转录（定量PCR用）

2.2.3 cDNA反转录（普通PCR用）

2.2.4 基因克隆

2.2.5 PCR产物回收

2.2.6 连接克隆载体

2.2.7转化大肠杆菌感受态细胞

2.2.8 测序

2.2.9 质粒DNA提取

2.2.10 质粒DNA酶切

2.2.11 植物过量表达载体构建

2.2.13 发根农杆菌RNA干扰（RNAi）载体构建

2.2.16 农杆菌转化

2.2.17 拟南芥种植

2.2.18 拟南芥遗传转化

2.2.19 苹果愈伤组织培养

2.2.20 苹果愈伤遗传转化

2.2.21 苹果组培苗培养

2.2.22 发根农杆菌侵染苹果组培苗

2.2.23 植物DNA提取

2.2.24 植物总蛋白提取

2.2.25 酵母双杂交

2.2.26 原核蛋白诱导和破碎

2.2.27 GST Pull-down实验

2.2.28 Co-IP沉淀蛋白实验

2.2.29 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

2.2.30 蛋白免疫印迹实验（Western blot）

2.2.31 凝胶变动迁移实验（EMSA）

2.2.32 体外SUMO实验

2.2.33 体内SUMO实验

2.2.34 体内泛素结合实验

2.2.35 体内蛋白降解实验

2.2.36 GUS组织化学染色

2.2.37 GUS酶活测定

2.2.38 病毒载体瞬时侵染愈伤

2.2.39 叶绿素含量测定

2.2.40 铁含量测定

2.2.41 亚铁离子菲洛嗪（Ferrozine）染色

2.2.42 质膜H+-ATP酶活性的测定

2.2.43 外泌H+染色

2.2.44 植物花青苷含量测定

2.2.46 愈伤组织花青苷着色实验

2.2.46 病毒载体瞬时注射苹果

3 结果与分析

3.1 MdSIZ1响应缺铁逆境调控苹果铁吸收动态平衡

3.1.1 MdSIZ1调控PM H+-ATPase介导的苹果缺铁响应

3.1.2 MdSIZ1与MdbHLH104直接互作

3.1.3 MdSIZ1在K139和K153位点处将MdbHLH104 SUMO化

3.1.4 MdSIZ1通过抑制泛素/26S蛋白酶体途径稳定MdbHLH104蛋白

3.1.5 MdbHLH104的SUMO化影响其铁吸收功能

3.1.6 MdSIZ1部分依赖MdbHLH104促进苹果质子外泌及铁吸收

3.2 MdSIZ1响应适度低温逆境调控苹果花青苷积累

3.2.1 MdSIZ1调控适度低温下苹果花青苷生物合成

3.2.2 MBS顺式作用元件对MdSIZ1启动子响应适度低温具有重要作用

3.2.3 MdMYB2直接结合MdSIZ1启动子的MBS顺式作用元件

3.2.4 MdMYB2转录调控MdSIZ1

3.2.5 MdSIZ1位于MdMYB2下游促进苹果花青苷积累

4 讨论

4.1 MdSIZ1响应缺铁逆境调控苹果铁吸收动态平衡

4.1.1MdSIZ1部分通过MdbHLH104调控苹果PM H+-ATPase活性

4.1.2 MdSIZ1调控苹果抗逆与养分吸收

4.2 MdSIZ1响应适度低温逆境调控苹果花青苷积累

4.2.1 MdSIZ1通过MdMYB2响应适度低温逆境

4.2.2 MdSIZ1位于MdMYB2下游调控苹果花青苷积累

5 结论

参考文献

7 附录

致谢

9 攻读学位期间发表及待发表的论文