桃果实发育过程中转录组变化及PpGLK1基因的功能分析

摘要

桃属于蔷薇科李属，二倍体物种（N=8），其基因组大小为250Mb，约是拟南芥的二倍。相比蔷薇科其它物种，桃树能够自交亲和，童期较短（2-3年），这使得桃树成为蔷薇科研究的模式植物。 GLK基因是GARP家族中包含MYB结构域的一类转录因子。本研究以‘鲁油1号’为试材，从生理、生化和分子生物学水平分析了桃果实发育过程中果皮色素含量、叶绿体超微结构、差异基因以及GLK转录因子的生物学功能，为进一步研究桃果树光合作用提高果实产量及品质提供理论依据。主要研究结果如下： （1）盛花后33d，叶绿素含量达到最高，为120.02μg/g，盛花后68d，叶绿素含量最低，为15.44μg/g；盛花后33d类胡萝卜素含量最高，为29.38μg/g，盛花后61d，含量最低为10.68μg/g；花青苷含量在果实发育前期较低，盛花后61d出现迅速升高，盛花后68d，花青苷含量为505.59μg/g。桃果皮叶绿体超微结构观察发现：盛花后19，26，33d，叶绿体为梭形，存在基粒片层，淀粉粒以及与叶绿体长轴平行的类囊体等结构。盛花后47d，叶绿体为椭圆形，内部类囊体排列出现混乱。盛花后61d，叶绿体内出现质体球滴结构。盛花后68d，叶绿体转化为有色体。 （2）以桃果皮为试材，分别构建了盛花后19d与68d cDNA文库，得到41,069,924和40,869,003个clean reads，通过与不同公共数据库比对，对差异基因进行注释，差异基因个数为6540，其中下调基因为3414个，上调基因为3126个。通过qRT-PCR技术进一步验证1个与叶绿体发育相关基因、4个与叶绿素生物合成相关基因、12个与光合作用相关基因、3个与叶绿素降解基因以及5个与花青苷生物合成相关基因的表达量，结果显示这些基因的表达模式与转录组分析结果一致。 （3）通过比对筛选，最终在桃基因组中发现一个GLK转录因子，命名为PpGLK1。PpGLK1开放阅读框为1626bp，编码542个氨基酸，等电点为6.06，分子量为59.17kDa。系统进化树分析表明，PpGLK1与SlGLK2及AtGLK1相似性较高。通过瞬时转化烟草及洋葱上表皮细胞，Confocal观察表明PpGLK1基因定位于细胞核。组织特异性表达分析发现PpGLK1基因主要在叶片及绿色果皮中表达。 （4）通过VIGS侵染桃叶片及未成熟果实，经检测分析表明，PpGLK1干扰表达的叶片及果实中叶绿素含量低于对照，PpGLK1及其靶基因表达量低于对照，暗示PpGLK1对叶绿素含量为正调控关系。构建pRI101-PpGLK1正义植物表达载体，转化拟南芥Atglk1Atglk2突变体，获得功能互补转化植株，对T3代植株进行叶绿素含量检测。结果表明，Atglk1Atglk2互补株系中叶绿素含量增加。利用农杆菌介导的叶盘法转化‘Micro-Tom’番茄，通过qRT-PCR及Western Blot杂交检测转基因植株。与野生型相比，转基因株系中未成熟果实为深绿色，叶绿素含量增加，叶绿体体积变大，生长素含量提高。qRT-PCR分析表明，PpGLK1及其靶基因表达量在过表达株系中上调。 （5）以‘鲁油1号’桃果实为试材，提取RNA，质量检测DnaseⅠ处理后，反转录合成cDNA，对均一化cDNA酶切处理去除短片段，克隆到pGADT7载体，测序扩增并提取质粒。经检测，初级文库库容为1.9×106cfu，插入片段长度范围为400-2000bp，平均长度大于1000bp，重组率约为98%。克隆PpGLK1基因全长、1-300氨基酸（a.a）区段、301-542（a.a）区段，连接pGBKT7载体，转化酵母感受态Y2H Gold，涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal固体培养基，验证诱饵载体的毒性及自激活作用。结果表明，PpGLK1-pGBKT7，PpGLK1（1-300a.a）-pGBKT7，PpGLK1（301-542a.a）-pGBKT7诱饵载体对Y2H Gold没有毒性。PpGLK1-pGBKT7，PpGLK1（1-300a.a）-pGBKT7在酵母感受态Y2H Gold中存在自激活，PpGLK1（301-542a.a）-pGBKT7诱饵载体没有自激活作用，可用于下一步试验。 （6）利用PpGLK1（301-542a.a）-pGBKT7为诱饵载体，筛选‘鲁油1号’桃果实的cDNA文库，涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基，挑选单克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上进行显色，经测序、Blast分析，最后筛选出16个基因。利用酵母双杂交、Pull-down、BiFC技术对筛选到的PpARF5进行验证，进一步表明PpGLK1能够与PpARF5互作。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1桃的起源

1.2桃基因组测序及国内外研究进展

1.3转录组测序技术的研究进展

1.3.1 RNA-seq应用于果实发育及品质研究

1.3.2发现新基因

1.3.3开发分子标记

1.3.4筛选差异基因、研究基因功能

1.4高等植物叶绿体装备过程

1.4.1核编码基因的导入

1.4.2类囊体装备

1.4.3叶绿体的分裂与发育调控

1.5叶绿体转化成有色体

1.6果实光合作用

1.7 GLK转录因子研究进展

1.7.1 GLK转录因子的发现

1.7.2 GLKs转录因子在不同物种中的进化及保守性

1.7.3 GLK转录因子的功能

1.8本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株、质粒及载体

2.1.3酶及生化试剂

2.1.4 PCR引物

2.1.5培养基

2.1.6抗生素

2.1.7溶液及缓冲液

2.2试验方法

2.2.1叶绿素、类胡萝卜素含量测定

2.2.2花青苷含量测定

2.2.3透射电镜观察

2.2.4生长素含量测定

2.2.5桃果皮转录组测序

2.2.6转录组生物信息学分析

2.2.7植物组织总RNA的提取

2.2.8反转录cDNA第一条链的合成

2.2.9荧光定量PCR

2.2.10基因扩增

2.2.11 PCR产物的回收

2.2.12连接反应

2.2.13大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.14大肠杆菌感受态细胞的转化及克隆筛选

2.2.15测序

2.2.16大肠杆菌质粒DNA的提取

2.2.17质粒DNA的酶切

2.2.18表达载体的构建

2.2.19根癌农杆菌LBA4404和GV3101感受态细胞的转化

2.2.20植物转化

2.2.21转基因植株的筛选

2.2.22制备酵母菌株Y2H Gold感受态细胞

2.2.23转化诱饵载体到Y2H Gold菌株

2.2.24诱饵载体的毒性检测

2.2.25诱饵载体的自激活

2.2.26 PpGLK1（301-542 a.a）-pGBKT7诱饵筛选酵母双杂交cDNA文库

2.2.27回复杂交验证

2.2.28 Pull-down

2.2.29 BiFC

3结果与分析

3.1桃果皮色素含量及叶绿体超微结构分析

3.1.1桃果皮色素含量的测定

3.1.2质体超微结构分析

3.2转录组分析

3.2.1桃果皮总RNA的质量检测

3.2.2转录组测序原始数据分析

3.2.3差异表达分析

3.2.4差异表达基因的GO富集分析

3.2.5 qRT-PCR验证

3.3 PpGLK1的生物学功能验证

3.3.1 PpGLK1的生物信息学分析

3.3.2 PpGLK1表达模式分析和亚细胞定位

3.3.3病毒诱导的PpGLK1基因沉默影响桃的靶基因和叶绿素含量

3.3.4异源转化拟南芥

3.3.5番茄的遗传转化

3.4 PpGLK1能够与PpARF5互作

3.4.1桃果实酵母双杂交cDNA文库构建

3.4.2酵母双杂交筛选与PpGLK1互作的蛋白

3.4.3酵母双杂交验证PpGLK1与PpARF5互作

3.4.4 Pull-down验证PpARF5与PpGLK1互作

3.4.5 BiFC

4讨论

4.1果实发育过程中果皮变化分析

4.2 PpGLK1基因同源性及表达分析

4.3 PpGLK1基因的功能鉴定

4.4 PpGLK1与PpARF5互作分析

5结论

参考文献

附录

7.1本文中使用的引物

7.2系统进化树分析序列

致谢

攻读学位期间发表论文情况