基于亲水色谱技术的灵芝、黄芪多糖特征指纹图谱研究

摘要

糖类成分是中药发挥药效作用的重要组成部分，具有极性强、化合物类别多、分子量范围广、含量差异性大等特点，由于独特的结构特点，造成其色谱分离过程中保留差、分离度低，其分析表征研究成为科学研究的重点。亲水色谱是一种特别适合强极性和亲水性物质分离的新型色谱分离技术。本研究发展了亲水色谱-电雾式检测器（HILIC-CAD）联用技术用于灵芝和黄芪中糖类成分分析表征的方法，为快速探明药食两用天然产物中糖类成分药用物质基础，提高其质量控制水平提供方法和技术支持,具有重要的理论价值及应用前景。主要研究内容如下： 1.基于部分酸解-亲水色谱技术的灵芝多糖特征指纹图谱研究 本研究发展了超声辅助热水浸提-苯酚-硫酸法测定灵芝多糖的方法，对不同来源（赤芝、黑芝、紫芝和青芝）灵芝多糖的含量进行测定。最佳提取条件为：提取温度90℃，料液比1∶15（g/mL），提取时间30min。不同品种的灵芝多糖含量存在一定差异，青芝的多糖含量最高，为2.68%；赤芝多糖含量其次，为2.01%；黑芝和紫芝多糖含量较为接近，分别为1.62%和1.61%。不同产地的赤芝多糖含量对比结果表明，多糖含量：吉林长白山地区＞安徽地区＞泰山地区。 本研究建立了一种灵芝多糖中单糖组成的超声辅助酸解-HILIC-CAD快速分析方法，采用超声辅助三氟乙酸（TFA）水解灵芝多糖，采用HILIC-CAD对灵芝多糖的单糖组成和含量进行分析和测定。水解条件为4mol/L的TFA在70℃下超声（功率为270W）1h。不同品种的灵芝多糖均含有岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7种单糖，但其单糖含量和比例存在一定差异：青芝中半乳糖含量非常低，同时黑芝中木糖含量远远高于其余三种灵芝，而紫芝中的葡萄糖和半乳糖含量明显较高。 本研究建立了基于部分酸水解-HILIC-CAD的灵芝多糖指纹分析新方法，对不同来源灵芝多糖进行指纹分析。结果表明，最佳水解条件为：TFA浓度4moL/L、温度80℃，水解时间5h。4种灵芝多糖水解产物中均检出鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7种单糖，其中，阿拉伯糖和葡萄糖含量相对较高，但青芝中阿拉伯糖和甘露糖的相对含量最高；泰山赤芝多糖样品中的鼠李糖和木糖含量明显高于安徽和东北的赤芝多糖样品，但葡萄糖的含量呈现完全相反的趋势。相似度分析表明，各样品相似度范围在0.2285~0.9604之间，说明不同品种灵芝样品其所含多糖成分存在一定差异。 2.基于部分酸解亲水色谱技术的黄芪多糖特征指纹图谱研究 本研究将荧光辅助糖凝胶电泳技术应用于APS部分酸水解产物的分析中。对凝胶电泳条件进行了详细的优化，结果表明：最佳电泳条件为以ANTS为衍生化试剂，在37℃下反应17h，在30%的分离胶上电泳。采用该方法，单糖（葡萄糖和木糖）混合物以及果胶半乳糖和蓝色葡聚糖都可以实现较好的分离，但对黄芪多糖部分酸水解产物的分离有待提高。 对黄芪多糖部分酸解条件进行了系统优化，最佳水解条件为：TFA浓度1moL/L、温度80℃，水解时间4h。应用部分酸水解-HILIC-CAD多糖指纹分析方法对不同来源黄芪多糖进行指纹分析，结果表明：不同黄芪样品水解成分中都含有岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、1-蔗果三糖和耐斯糖10种糖组分。但内蒙古地区的岩藻糖、鼠李糖、甘露糖和半乳糖的含量明显低于山西地区的，而阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和耐斯糖的含量呈现完全相反的趋势；葡萄糖含量远高于其他几种糖组分的含量。不同产地间样品相似度范围为0.9661~0.9973，说明选取的特征色谱峰分离度较好、可以稳定出现。 本研究建立的基于HILIC-CAD技术的多糖特征指纹图谱法，包含了粗多糖含量测定，多糖的单糖组成，以及多糖水解物的差异分析。为药食两用中药多糖质量评价水平的提高提供技术支撑。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1糖谱技术概述

1.2天然来源的糖类组分指纹图谱研究方法

1.2.1光谱分析法

1.2.2色谱分析法

1.3天然多糖的分析和检测技术

1.3.1糖类化合物的水解

1.3.2糖类化合物的检测

1.4灵芝、黄芪多糖质量研究概述

1.4.1灵芝

1.4.2黄芪

1.5本论文的研究内容及意义

1.5.1研究意义

1.5.2研究内容

2 材料与方法

2.1材料

2.2主要试剂

2.3主要仪器

2.4灵芝多糖特征指纹图谱研究的实验方法

2.4.1超声辅助提取苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量

2.4.2超声辅助酸解-HILIC-CAD测定不同品种灵芝多糖的单糖组成

2.4.3基于部分酸解亲水色谱技术的灵芝多糖特征指纹图谱研究

2.5基于部分酸解亲水色谱技术的黄芪多糖特征指纹图谱研究的实验方法

2.5.1基于凝胶电泳技术的FACE分析黄芪多糖

2.5.2基于HILIC技术的黄芪多糖部分水解指纹图谱的建立

3 结果与分析

3.1不同来源灵芝多糖含量的比较分析

3.1.1多糖提取条件的优化

3.1.2标准曲线与回归方程

3.1.3不同品种灵芝多糖含量分析

3.1.4不同产地赤芝多糖含量分析

3.2不同品种灵芝多糖的单糖组成分析

3.2.1灵芝多糖酸解条件优化

3.2.2色谱条件优化

3.2.3方法学考察

3.2.4样品测定

3.2.5不同品种灵芝样品中单糖组成差异分析

3.2.6灵芝多糖水解产物的单糖组成分析

3.3基于部分水解的灵芝多糖特征指纹图谱的研究

3.3.1水解条件优化

3.3.2方法学考察

3.3.3样品测定

3.3.4特征指纹图谱的构建

3.3.5灵芝粗多糖样品指纹图谱的相似度评价

3.3.6单糖组成比较

3.3.7指纹图谱专属性验证

3.4 FACE分析黄芪多糖

3.4.1电泳条件优化

3.4.2电泳条件适用性的验证

3.4.3不同产地黄芪多糖部分酸水解产物的FACE图谱

3.5黄芪多糖部分水解指纹图谱的研究

3.5.1水解条件优化

3.5.2色谱峰的指认

3.5.3方法学考察

3.5.4样品测定

3.5.5粗多糖含量测定法与HILIC-CAD方法比较

3.5.6特征指纹图谱的构建与相似度评价

3.5.8指纹图谱专属性验证

4 讨论

4.1超声辅助提取苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量的研究

4.2超声辅助酸解-HILIC-CAD测定不同品种灵芝多糖中单糖组成的研究

4.3基于部分酸解亲水色谱技术的灵芝多糖特征指纹图谱的研究

4.4荧光辅助糖凝胶电泳分析黄芪多糖

4.5部分水解-HILIC指纹图谱分析黄芪多糖

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文