山东省鸡产品弓形虫感染情况的调查分析

摘要

刚地弓形虫（Toxoplasma Gondii）是一种专性细胞内寄生原虫，是一种重要的人畜共患病病原，其宿主类型众多，在世界范围内流行，对人类健康和畜牧业健康发展具有潜在威胁。携带弓形虫包囊的肉制品是人感染弓形虫非常重要的途径之一。因此，了解家畜家禽弓形虫感染情况具有非常重要的公共卫生学意义。山东省是人口大省也是养鸡大省，鸡肉产品更是山东居民主要的肉制品之一，消耗量非常大。鸡肉产品的食品安全问题一直是市民关注的焦点。当前，国内外有较多关于家禽弓形虫感染情况的调查研究，但是鲜有山东省家禽养殖业弓形虫感染的相关研究。在2000年和2008年有山东省鸡弓形虫感染情况的报道，但是其样本量较少，且缺乏不同养殖方式弓形虫感染率的比较。另外，弓形虫感染情况的调查结果并不能完全反应食品的安全风险。。为了解山东省鸡产品的弓形虫感染情况并进行相应的食品安全风险评估，本研究从山东省8个地级市采集了1653份规模化养殖和散养鸡的心脏样本进行弓形虫感染情况调查，比较了规模化养殖和散养两种养殖方式下弓形虫感染的差异，通过小鼠感染实验评估了其食品风险。 本研究包括三个部分： 第一部分 巢式PCR检测鸡肉产品弓形虫感染情况。以弓形虫ITS-1基因为靶基因，在本实验室已有弓形虫巢式PCR检测方法的基础上对引物进行优化改进，确定了本研究使用的PCR反应体系和反应条件。 第二部分 山东省部分地区不同来源的鸡肉产品弓形虫感染情况的调查。本研究从山东省临沂市、潍坊市、聊城市、滨州市、烟台市、威海市、菏泽市、淄博市等8个地级市的20多个县随机采集1653份鸡心脏样本。苯酚-氯仿-异戊醇法抽提样本DNA作为模板，用建立的巢式PCR进行分子生物学检测。PCR结果显示，1653份鸡心样本中阳性样本204个占12.34%。实验结果表明，山东省普遍存在感染弓形虫的现象，其中临沂市、潍坊市、聊城市、滨州市、烟台市、威海市、菏泽市、淄博市的阳性率分别为13.33%（36/270）、20.98%（64/305）、6.67%（12/180）、9.23%（12/130）、7.69%（13/143）、11.11%（30/270）、9.41%（16/170）、10.73%（22/205），阳性率范围在6.67%～20.98%，不同地区鸡弓形虫感染的阳性率差异显著（P<0.05）。进一步对所采超市和农贸市场的鸡肉产品样本的弓形虫检出率进行了统计分析，结果发现不同养殖方式下弓形虫的感染情况有较大差异，其中超市的鸡肉产品弓形虫感染率为9.33%，农贸市场弓形虫检出率为14.95%。地区不同，样本的弓形虫检出率也存在较大差异。其中临沂市、潍坊市、聊城市、滨州市、烟台市、威海市、菏泽市、淄博市的超市样本的弓形虫感染阳性率分别为10.83%，13.13%，5.56%，5.00%，6.66%，9.17%，7.78%；农贸市场样本的阳性率分别为15.33%，29.65%，7.78%，12.86%，10.84%，12.67%，11.25%，11.85%。结果表明，山东省农贸市场样本的弓形虫感染率要明显高于超市样本的养殖鸡群，这可能是由于超市样本多为规模养殖场的，农贸市场样本多为散养的，散养饲养方式接触污染水源和饲料的几率高，这从一定程度上反应了环境中弓形虫的污染情况。 第三部分 小鼠感染实验。将样本中感染了弓形虫的阳性样本感染小鼠来评估其食品安全性。从规模化养殖和散养鸡肉产品PCR阳性的样本中各挑出一部分进行组织捣碎，捣碎的样本通过口服或腹腔接种SPF昆明鼠。每个样品盲传三代，每传一代将昆明鼠的心脏，肝脏，脾脏，大脑组织用建立的巢式PCR方法检测其弓形虫的感染情况，并对各检测的组织进行切片染色来验证。PCR结果显示，没有从小鼠组织器官内检测到弓形虫，且组织切片中也未发现弓形虫的包囊或其他阶段的虫体。这可能是由于市场销售的冷冻鸡产品携带的弓形虫包囊失去了再感染能力或者是流通中时间因素导致感染能力降低。 本研究对山东省8个地级市共20多个县的超市和农贸市场进行了弓形虫感染情况的调查，并通过小鼠感染实验评估了其食品的安全风险。结果表明，受检鸡群中普遍存在弓形虫的感染，且超市样本的感染率显著高于农贸市场的感染力。通过弓形虫阳性样本感染小白鼠实验表明鸡肉产品弓形虫感染的食品安全风险可控。

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Abstract

1.1弓形虫简介

1.1.1弓形虫的发现

1.1.2弓形虫病原特征

1.1.3弓形虫生活史

1.2弓形虫病传播及危害

人弓形虫病绝大部分是通过动物传播，但也可以通过垂直的方式发生先天性感染。人主要是通过食用含有弓形虫包

1.2.2弓形虫病在畜禽上的传播与危害

猪、牛、羊也的弓形虫感染非常普遍，给养殖业带来巨大的经技损失。幼畜感染弓形虫一般会出现呼吸困难、恪守

鸡弓形虫病感染通常潜伏期为5-7天左右，日龄不同、品系不同、弓形虫毒力不同最终的临床表现有较大差异。

1.3主要畜禽弓形虫病流行病学研究进展

国外学者对猪弓形虫感染情况调查不是很广泛，美国疫病防控中心调查了伊利诺斯州的47个养猪场弓形虫感染率

1.4弓形虫检测方法

1.4.1病原学诊断

1.4.2免疫学诊断

免疫学诊断是弓形虫病调查过程中常用到的方法，它具有特异性强，灵敏度高、操作简单快速等优势。通常急性弓

ELISA：通过检测感染弓形虫的畜禽或人的各种弓形虫特异抗体（IgM、IgA、IgE、IgG）或者循

DT：1948年由Sabin和Feldnlan发明的弓形虫血清学检测的方法。其原理是采用活的弓形虫滋

1.4.3分子诊断

1.5弓形虫特异性基因

能用于弓形虫特异性检测的靶基因很多，包括B1基因、P30基因、529重复序列、核糖体内转录间隔区（I

1.6本研究的目的和意义

2实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1 实验样本

2.1.2质粒、虫株与实验动物

2.1.3主要试剂

2.1.4酶

2.1.5主要仪器和设备

2.1.6 主要试剂配制

2.2方法

2.2.1PCR弓形虫检测方法的优化

2.2.2试验样品的采集与处理

2.2.2.1试验样本基因组DNA的提取

2.2.2.2样本处理

2.2.2.3样本基因组DNA的提取

2.2.2.4基因组DNA纯度与浓度检测

2.2.3.1样本一次PCR

2.2.3.2样本二次PCR

2.2.4阳性样本测序

2.2.4.1PJET1.2基础质粒的准备

2.2.4.2Blunt载体的制备

PJET1.2质粒经EcoRV内切酶酶切后可以获得平末端的Blunt载体。

挑取部分阳性PCR样本进行PCR反应，为了确保产物可靠，本轮PCR扩增用高保真酶扩增，PCR产物 参

2.2.5小鼠感染实验

3.1巢式PCR方法条件优化

3.1.1引物设计

3.1.2特异性试验

3.1.3敏感性试验

3.2样本采集与处理

3.2.1 样本采集

分别从8个不同的地区鸡心样本中各选取3个样本DNA抽提，抽提的DNA样本进行纯度和浓度测定，测定结果

3.3 样本巢式PCR结果

3.3.1 样本一次PCR结果

按照方法中体系对鸡心样本DNA进行PCR检测，引物为Tg-ITS-F1/Tg-ITS-R1。结果发现

3.3.2 样本二次PCR结果

3.3.2.1 临沂市PCR结果

临沂市270份样本中有36份为PCR阳性，阳性率为13.33%其中规模化养殖鸡群阳性率为 10.83

3.3.2.2 潍坊市PCR结果

潍坊市305份样本中有64份为PCR阳性，阳性率为20.98%其中规模化养殖鸡群阳性率为 13.13

3.3.2.3 聊城市PCR结果

聊城市180份样本中有12份为PCR阳性，阳性率为6.67%其中规模化养殖鸡群阳性率为 5.56%

3.3.2.4 滨州市PCR结果

（图9）。

3.3.2.5 烟台市PCR结果

烟台市143份样本中有13份为PCR阳性，阳性率为7.69%其中规模化养殖鸡群阳性率为 6.66%

3.3.2.6 威海市PCR结果

威海市270份样本中有30份为PCR阳性，阳性率为11.11%其中规模化养殖鸡群阳性率为 9.17%

3.3.2.7 菏泽市PCR结果

菏泽市170份样本中有16份为PCR阳性，阳性率为9.41%其中规模化养殖鸡群阳性率为 7.78 %

3.3.2.8 淄博市PCR结果

淄博市205份样本中有22份为PCR阳性，阳性率为10.73%其中规模化养殖鸡群阳性率为 8.57%

3.4 阳性样本测序结果

3.4.1 Blunt载体制备

PJET1.2载体两个EcorV酶切位点之间有300bp左右的核苷酸片段，酶切结果 （图14）显示P

3.4.2 菌液PCR结果

每个城市选择3份阳性样本进行Blunt载体克隆，每个平板选择8个单克隆菌落进行PCR鉴定，图

3.4.3 PCR阳性结果测序

3.5阳性率统计分析

3.5.1阳性率统计表

对本次采集样本进行阳性率统计，总阳性率为12.34%，该结果显示山东省鸡弓形虫的感染是非常普遍的。

3.5.2不同地区阳性率对比

对不同地区阳性率进行统计，结果发现，不同地区弓形虫检出率不同，且存在较大差异，以潍坊市检出率最高为2

3.5.3不同养殖方式阳性率对比

本研究对山东省不同地区、不同养殖方式鸡群弓形虫检出率进行比较，结果发现规模化养殖鸡群弓形虫阳性率显著

3.6 小鼠感染实验

3.6.1人工感染小鼠PCR检测结果

本研究对每次传代感染的昆明鼠的大脑组织进行弓形虫PCR检测，结果显示出阳性对照呈PCR阳性外没有样本

3.6.2人工感染小鼠HE染色结果

本研究对每次传代感染的昆明鼠的心脏、肝脏、脾脏等组织进行组织切片，切片经过HE染色后显微镜下观察。H

肝脏HE染色结果：

脾脏HE染色结果：

心脏HE染色结果：

4 讨论

5 结论

参 考 文 献

攻读硕士学位期间发表的论文