苹果转录因子MdMYC2与MdERF3对α-法尼烯生物合成的转录调控

摘要

α-法尼烯是一种倍半萜类挥发性有机化合物，存在于多种植物的叶片、花和果实中,它在植物防御中扮演着重要角色，同时也与植物的抗冷性、昆虫的诱导及低温贮藏的苹果和梨果实重大的生理代谢紊乱－虎皮病的发生有关。法尼烯又是一种优良生物燃料法尼烷的前体，近年来受到了人们的广泛关注，具有广阔的市场价值。以往有关α-法尼烯的研究大多集中在其代谢途径中关键酶的基因克隆、生物学功能和代谢工程上，而转录因子对苹果α-法尼烯生物合成的调控机制未见报道。本项研究结果发现，苹果中的转录因子MdMYC2(bHLH转录因子)和MdERF3（Ethylene response factor3）能够激活α-法尼烯合成途径中最后一步关键酶基因MdAFS的启动子区域，上调MdAFS基因的表达，从而使下游产物α-法尼烯得到积累。主要结论如下： （1）利用qRT-PCR技术对MdAFS基因在青香蕉苹果叶片的激素诱导表达进行分析，发现MdAFS基因表达受茉莉酸（JA）、乙烯（ETH）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）激素的调节。在常温和低温储藏条件下，利用JA、ETH处理苹果果实均能促进α-法尼烯的合成，而1-MCP处理则抑制α-法尼烯的合成。 （2）利用PlantCARE数据库对MdAFS基因启动子进行分析预测，发现启动子区域存在多种响应植物激素（ETH、JA、ABA）和非生物胁迫的顺式作用元件，以及多个MYB、MYC结合位点。根据结合位点的分析，我们筛选到了茉莉酸、乙烯途径中的重要转录因子MdMYC2、MdERF3，研究α-法尼烯合成的调控机制。qRT-PCR分析结果表明，JA、ETH处理诱导MdMYC2、MdERF3的上调表达，同时MdAFS也上调表达，表明MdMYC2、MdERF3与MdAFS基因表达具有相关性。 （3）烟草荧光素酶试验表明，转录因子MdMYC2和MdERF3能够激活MdAFS基因启动子。酵母单杂交试验发现，转录因子MdMYC2和MdERF3可以在体外结合MdAFS基因启动子。EMSA试验结果进一步分析发现，转录因子MdERF3能够与MdAFS启动子上的DRE元件直接结合。在苹果愈伤组织中分别过表达MdMYC2和MdERF3，MdAFS基因的表达量均升高，而沉默MdMYC2的愈伤组织中，MdAFS基因的表达量降低。 （4）利用果实瞬时转化体系在青香蕉苹果果皮中过量表达转录因子MdMYC2和MdERF3，GC-MS检测结果表明，过表达MdMYC2和MdERF3显著促进了α-法尼烯的合成。 （5）转录因子MdMYC2和MdERF3还同时影响α-法尼烯合成途径中的其它关键酶基因HMGR和FPPS的表达，表明转录因子MdMYC2和MdERF3通过激活α-法尼烯代谢途径中多个基因的协同表达，有效地提高α-法尼烯的合成量。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1植物萜类物质及代谢

1.1.1植物萜类物质

1.1.2萜类物质合成途径

1.1.3萜类物质代谢工程

1.2α-法尼烯及α-法尼烯合酶研究进展

1.2.1α-法尼烯

1.2.2α-法尼烯合酶

1.2.3α-法尼烯合成途径中的关键酶

1.3植物萜类化合物转录水平的调控

1.3.1 MYB类转录因子

1.3.2 WRKY类转录因子

1.3.3 bZIP类转录因子

1.3.4 bHLH类转录因子

1.3.5锌指类转录因子

1.4 MYC与AP2/ERF转录因子

1.4.1 MYC转录因子的研究进展

1.4.2 AP2/ERF转录因子的研究进展

1.5本实验的目的意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2材料处理与取样

2.1.3载体与菌株

2.1.4酶和化学试剂

2.1.5实验引物

2.2实验方法

2.2.1植物基因组DNA提取

2.2.2多糖多酚植物总RNA提取

2.2.3 cDNA第一链的合成

2.2.4实时荧光定量PCR

2.2.5表达载体的构建

2.2.6冰融法转化农杆菌

2.2.7烟草荧光素酶试验

2.2.8酵母单杂交试验

2.2.9蛋白原核表达和纯化

2.2.10 凝胶电泳迁移试验（EMSA）

2.2.11果皮中α-法尼烯的测定

2.3数据统计分析

3 结果与分析

3.1 MdAFS在激素处理下的表达分析

3.2 MdAFS基因启动子的克隆及分析

3.3 MdMYC2、MdERF3与MdAFS基因表达具有相关性

3.4 MdMYC2与MdERF3的基因克隆

3.5 MdMYC2与MdERF3对MdAFS基因启动子转录活性的分析

3.5.1烟草荧光素酶试验分析MdMYC2、MdERF3对MdAFS启动子的转录调控

3.5.2酵母单杂交试验验证MdMYC2、MdERF3结合MdAFS基因启动子

3.5.3 EMSA试验验证MdERF3直接结合MdAFS基因启动子

3.6 MdMYC2与MdERF3正调控苹果愈伤组织中MdAFS的表达

3.6.1 MdMYC2正调控苹果愈伤组织中MdAFS的表达

3.6.2 MdERF3正调控苹果愈伤组织中MdAFS的表达

3.7 MdMYC2与MdERF3促进α-法尼烯合成

3.7.1过表达MdMYC2促进α-法尼烯合成

3.7.2过表达MdERF3促进α-法尼烯合成

3.8 MdMYC2与MdERF3正调控苹果愈伤组织中MdHMGR2的表达

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢