过表达苹果α-法尼烯合酶基因烟草早衰机制研究

摘要

烟草是一年生或有限多年生草本植物，是重要的经济作物。因其腺体丰富，具有大量的绿色组织，使其成为萜类代谢工程研究的理想模式植物。
　　α-法尼烯是一种挥发性倍半萜烯，α-法尼烯合酶是催化α-法尼烯合成的最终限速酶。到目前为止，对苹果α-法尼烯的研究主要集中在α-法尼烯及其氧化产物-共轭三烯醇类物质（Conjugated Trienols，CTols）与苹果虎皮病发生的关系。在植物中过表达苹果α-法尼烯合酶基因是否影响其他萜类物质的合成及植物生物学特性的研究相对较少。本研究以过表达苹果α-法尼烯合酶基因烟草的T3代植株为实验材料，通过转录组分析代谢通路和代谢物，解释转基因烟草早衰的原因和机制。主要结果如下：
　　（1）植物萜类的合成与释放具有组织器官特异性。MdAFS基因在转基因烟草的茎中表达量最低，根和叶片次之，花中表达量最高，是茎的3.6倍。GC/MS分析烟草萜类组分发现，在根、茎、叶、花中均未检测到目的产物法尼烯的释放，但施用钾离子处理后，烟草花中检测出法尼烯。
　　（2）机械损伤，茉莉酸甲酯（MeJA），赤霉素（GA），水杨酸（SA），乙烯利（ETH），4℃，42℃，聚乙二醇-6000（PEG-6000）和H2O2处理明显诱导了青香蕉苹果苗MdAFS基因的表达，其中，4℃处理后MdAFS基因的表达一直稳定在较高水平；伤害处理表现出先升高后下降的规律；MeJA，GA，SA，ETH，PEG-6000，H2O2和42℃高温处理表现出某一时间点爆发式上调的特点，42℃处理效果最明显上调大约170倍。在实验条件下青香蕉苹果苗MdAFS基因的表达具有节律性，在照光1h后出现最大表达量。
　　（3）目前，烟草（NC89）还没有可利用的全基因组数据库。利用De nove组装的方法进行烟草叶片和顶芽的转录组分析，共获得了249185条unigenes。叶片差异表达分析发现，抗氧化活性分类有26个下调转录本包括APX和CAT，类胡萝卜素代谢34个下调转录本，质体醌代谢14个下调转录本，抗坏血酸盐代谢10个下调转录本和氮代谢62个下调转录本。
　　（4）与野生型相比，转基因植株有较多的活性氧积累，转基因植株抗氧化防御系统下降，表现为抗氧化酶（APX，CAT和SOD）活性显著下降，抗氧化物质（类胡萝卜素，多酚和类黄酮）含量显著下降，并且对光合电子传递链阻断剂敌草隆（DCMU）处理更加敏感。
　　（5）在转基因植株中茉莉酸（JA），水杨酸（SA）和乙烯（ET）含量显著下降，乙烯释放速率降低；油菜素内脂（BR）含量显著增加，细胞分裂素（CTK）含量没有明显变化。
　　（6）光合作用是萜类合成的还原力和原料来源，转基因植株净光合速率下降，光合作用产物淀粉和可溶性糖含量显著下降。对光合作用、光合蛋白和碳固定信号通路分析分别发现了87，127和195个下调转录本，没有上调转录本。
　　（7）植物萜类的合成与释放具有时间特异性（不同发育时期），MdAFS基因随着烟草发育进程表达量不断增加，盛花期达到最高点。不同发育时期，萜类合成途径关键基因与MdAFS基因相关性分析表明，MdAFS基因与HMGR基因正相关，其他基因（DXS、DXR、IDI、FPPS和GPPS）负相关。
　　（8）转基因株系HMGR1、HMGR2和HMGS基因上调表达，HMGR专一性抑制剂洛伐他汀（MEV）处理也表明转基因植株有较高的HMGR转录水平。转基因株系萜类合成途径其它关键基因（DXS、DXR、IDI、FPPS和GPPS）下调表达，同时，对DXR专一性抑制剂膦胺霉素（FOS）处理不敏感。
　　（9）转基因株系叶片中，单萜（柠檬烯和芳樟醇）的释放对MeJA的诱导作用不敏感；转基因株系叶绿素和四萜（类胡萝卜素）含量显著下降，Fv/Fm值显著下降。qRT-PCR分析发现转基因株系叶绿素合酶基因下调表达，而叶绿素酶上调表达。添加萜类合成的原料丙酮酸能够将转基因株系的叶绿素含量恢复到野生型水平，合成减少是导致叶绿素含量下降的原因。