粗山羊草缺锌响应转录组分析及AeZIP2基因的功能鉴定

摘要

锌是植物体内最重要的微量金属元素之一，含锌蛋白占蛋白种类的十分之一，广泛参与各类酶的功能。缺锌会抑制植物的生长发育，影响植物的抗逆性、产量和品质，是限制农作物生产的重要原因之一。 粗山羊草是小麦D基因组的遗传基础，本研究利用水培缺锌筛选获得的低锌耐受能力差异显著的粗山羊草为材料，借助转录组学高通量测序，分析其响应锌胁迫的分子机制，对其中的ZIP基因家族成员进行了系统的生物信息学分析，从差异基因表达谱中筛选并克隆了一个AeZIP2基因，对序列特征、表达特性和生物学功能进行了系统分析。主要研究结果如下： 为鉴定粗山羊草对缺锌胁迫的耐受性，建立了叶片表型和地上部锌效率相结合的水培筛选体系。在缺锌培养三周后叶片坏死斑出现越早，低锌培养6周后锌效率越高，材料对缺锌胁迫的耐受能力越强。粗山羊草SQ523表现出比Y199更强的缺锌胁迫耐受能力，在胁迫条件下具有更强生理和代谢稳定性，根系对锌离子的吸收和向地上转运能力更强。 对粗山羊草SQ523响应缺锌（0μM）、低锌（0.05μM）和正常供锌（5μM）不同供锌水平的转录组分析表明，锌胁迫产生的DEGs数随胁迫强度增大而增加，根系转录组对缺锌胁迫强度的变化比叶更敏感。在根中缺锌胁迫对基因表达的调控以表达上调为主，而低锌胁迫下以表达下调为主。在叶中缺锌胁迫产生的DEGs在两个调控方向上没有明显差异。 SQ523差异表达基因的KEGG代谢富集分析表明，在根中，内质网蛋白加工和氮素代谢途径在基因表达上调方向上代谢富集，而植物激素信号转导、植物病原互作和苯丙醇生物合成途径在基因表达下调方向上代谢富集。富集的代谢途径主要来自缺锌胁迫。在叶中，基因表达上调方向上显著富集的代谢途径内质网蛋白加工和植物病原互作途径，两个富集突击途径来自低锌胁迫。在基因表达下调方向上，只有植物激素信号转导途径显著富集，来自缺锌胁迫，比根中少了两个途径。26个转录因子家族共217个成员受缺锌胁迫差异表达。不同转录因子家族在根或叶中的差异表达具有一定的组织特异性和表达调控方向的多样性。 粗山羊草ZIP基因家族的生物信息学分析表明，25个ZIP家族基因编码蛋白序列长度为100-550，20个质膜定位蛋白上跨膜区数为1-9个。粗山羊草响应低锌（0.05μM）、正常供锌（5μM）和高锌（500μM）的表达分析表明，8个基因存在较强的根或叶的组织特异性表达，5个基因具有低锌亲和转运体的表达特性，17个基因的表达具有高锌亲和转运体的表达特征。 从粗山羊草SQ523基因组中成功克隆得到一个AeZIP2基因，该基因编码全长349个氨基酸的质膜定位蛋白。AeZIP2及其直系同源蛋白含有9个跨膜区和两个可变区，跨膜区序列高度保守。表达特性分析表明AeZIP2是一个根特异性表达基因，受缺锌胁迫诱导表达。在甘露醇、NaCl和H2O2的胁迫后，AeZIP2基因表现出一定的诱导表达，而在高温、脱落酸、生长素处理后表达水平下调。在拟南芥中过表达AeZIP2基因能够增强对锌、铁、锰、铜的吸收。与野生型相比，转基因株系中生长素对根系生长调控的生理效应受到抑制，而对干旱、盐和氧化胁迫的抗性得以提高。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1锌在植物中的生物学功能

1.1.1锌影响蛋白质代谢

1.1.2锌调控糖代谢，影响光合作用

1.1.3锌影响脂类代谢和生物膜的功能

1.1.4锌影响核酸代谢和基因表达调控

1.1.5锌影响生长素的生物合成

1.1.6锌影响ROS代谢

1.1.7锌与其他营养元素的关系

1.2锌代谢的分子基础

1.3植物ZIP家族研究进展

1.4研究目的及意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3引物

2.1.4酶和各种生化试剂

2.1.5主要仪器设备

2.1.6软件和数据库资源

2.2实验方法

2.2.1植物材料的培养和处理

2.2.2拟南芥基因组DNA的提取

2.2.3植物总RNA的提取

2.2.4 cDNA的合成

2.2.5目的基因片段的PCR扩增

2.2.6扩增产物的胶回收

2.2.7目的基因片段与克隆载体的体外连接

2.2.8大肠杆菌感受态的转化

2.2.9大肠杆菌质粒DNA的提取

2.2.10植物重组表达载体的构建

2.2.11农杆菌感受态的转化

2.2.12农杆菌介导的拟南芥花序侵染转化

2.2.13蛋白质含量的测定

2.2.14脯氨酸含量的测定

2.2.15 T-SOD含量的测定

2.2.16转基因拟南芥纯合鉴定

2.2.17烟草表皮细胞中GFP融合蛋白的亚细胞定位

2.2.18转基因拟南芥的胁迫处理

2.2.19粗山羊草转录组分析

2.2.20粗山羊草基因家族分析

2.2.21数据统计分析

3 结果与分析

3.1粗山羊草缺锌耐性鉴定

3.2粗山羊草缺锌响应的转录组分析

3.2.1 SQ523响应缺锌胁迫差异表达基因（DEGs）的筛选

3.2.2 SQ523响应缺锌胁迫DEGs的KEGG富集分析

3.2.3 SQ523响应缺锌胁迫差异表达转录因子分析

3.2.4 SQ523和Y199响应低锌胁迫DEGs的筛选和KEGG富集分析

3.3粗山羊草ZIP家族蛋白序列及基因响应锌胁迫的表达分析

3.4粗山羊草AeZIP2基因克隆及功能鉴定

3.4.1粗山羊草AeZIP2基因的克隆

3.4.2粗山羊草AeZIP2蛋白的序列相似性及进化分析

3.4.3粗山羊草AeZIP2蛋白定位于质膜

3.4.4粗山羊草AeZIP2基因的表达特性分析

3.4.5过表达AeZIP2转基因拟南芥纯合系的获得

3.4.6过表达AeZIP2基因抑制拟南芥根系生长

3.4.7过表达AeZIP2基因影响拟南芥对多种营养元素的敏感性

3.4.8过表达AeZIP2基因可以促进拟南芥对多种金属元素的吸收

3.4.9过表达AeZIP2基因抑制IAA的生理效应

3.4.10过表达AeZIP2基因拟南芥对盐胁迫的抗性

3.4.11过表达AeZIP2基因增强拟南芥对干旱胁迫抗性

3.4.12过表达AeZIP2基因增强拟南芥对氧化胁迫的抗性

4 讨论

4.1植物缺锌耐性鉴定体系的优化

4.2粗山羊草响应缺锌胁迫的基因表达调控特性

4.3粗山羊草ZIP基因家族表达的生物学多样性

4.4粗山羊草AeZIP2基因介导植物生长发育和胁迫防御调控

5 结论

参考文献

附录

致谢