稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系建立及其特性研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）在世界范围内普遍流行，它是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS Virus，PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍、断奶仔猪呼吸道症状、生长迟缓以及高死亡率为特征的一种急性、高度传染的病毒性疾病。由PRRSV诱导细胞因子分泌的体外研究需要猪肺泡巨噬细胞（PAM）和与免疫细胞的相互作用。然而，已有的永生化PAM细胞不允许PRRSV感染。从猪原代PAM（pPAM）分离的猪CD163受体可赋予PRRSV对非易感细胞的感染性，从而建立新的细胞系以更方便地研究PRRSV感染动力学及其诱导相关细胞因子分泌的分子机制。本研究以pPAM扩增CD163基因，利用慢病毒表达系统将其插入到永生化PAM细胞的染色体中，使其随细胞增殖而稳定表达。试验鉴定显示，用高致病性（Highly Pathogenic）HP-PRRSV毒株JXA1感染mPAM-CD163细胞，能产生高于109copies/mL滴度的子代病毒；该细胞系能够稳定传代至少100代。此外，我们还研究了接种不同毒力PRRSV的mPAM-CD163和pPAM中的相关细胞因子和Toll-like receptors（TLR）的表达状况。mPAM-CD163细胞系与pPAM细胞相比显示了极其相似的病毒复制和细胞因子分泌规律。因此，本研究建立的稳定的表达CD163的PAM细胞系可替代原代PAM细胞用于体外实验，研究细胞因子分泌机制和PRRSV感染的PAM细胞与免疫细胞之间的相互作用。 从4-6周龄的PRRSV、PCV2双阴性仔猪肺中获取pPAM细胞，按照猪CD163的基因序列设计引物，利用PCR方法扩增猪CD163基因。将扩增的CD163基因片段连接到克隆载体pEASY-T1，构建克隆质粒pEASY-T1-CD163。用限制性内切酶Xba I和Xho I分别双酶切pEASY-T1-CD163和pLV-sf GFP(2A)Puro，从载体质粒pEASY-T1-CD163上将CD163基因克隆至慢病毒基因过表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中。将连接产物转化至E.coli Competent Cell JM109中，阳性重组质粒经测序鉴定命名为pLV-EGFP-CD163。 将无内毒素pLV-EGFP-CD163质粒加入到293T细胞中培养，收集培养液得到病毒颗粒。经过嘌呤霉素筛选出适合永生化PAM细胞生长的最佳浓度后，在含有嘌呤霉素的培养基中加入慢病毒颗粒进行感染，得到含有目的基因的细胞群细胞。将细胞群细胞稀释后接种到96孔板培养，采用有限稀释法获得单克隆细胞株。将筛选到的稳定表达CD163的单克隆细胞株命名为mPAM-CD163。 该细胞系经过Western blot试验，结果显示mPAM-CD163细胞中CD163蛋白得到了正确的表达，分子量约为130KDa。抗体阻断试验表明，抗CD163抗体与CD163结合后，与对照组相比PRRSV滴度以剂量依赖性方式减少。共聚焦结果显示，CD163蛋白主要定位在细胞的胞膜。此外，该细胞系允许PRRSV感染并且产生超过109copies/mL高滴度的子代病毒，该细胞系能够至少传代100代。用HP-PRRSV JXA1毒株和经典SD1株感染该细胞系，产生的病毒粒子数虽然低于pPAM，但是其变化趋势与pPAM相似。 用不同毒力的高致病性PRRSV JXA1毒株与经典PRRSV SD1毒株感染pPAM和mPAM-CD163细胞，荧光定量PCR方法测定相关细胞因子（IL-4、IL-10、IFN-α、IFN-γ）和Toll受体（TLR-3、TLR-7）的表达水平。结果显示，本实验构建的细胞系与pPAM细胞在细胞因子方面有几乎相同的变化规律，其中，在24hpi IL-4和6、12hpi IL-10的mRNA和上清水平与原代细胞的分泌不同；在Toll样受体mRNA表达的变化规律是一致的。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 PRRSV病原学特征

1.1.1 PRRSV的分类

1.1.2 PRRSV的理化特性

1.1.3 PRRSV的体外生长特性

1.1.4 PRRSV的致病机理

1.2 PRRSV基因组结构特征

1.2.1 PRRSV基因组

1.2.2 PRRSV编码的非结构蛋白

1.2.3 PRRSV编码的结构蛋白

1.3 PRRS的流行病学与临床症状

1.3.1 PRRS的流行病学特征

1.3.2 PRRS的临床症状

1.4 PRRSV细胞受体研究进展

1.4.1 病毒受体的概述

1.4.2 病毒侵入宿主细胞的过程

1.4.3 与PRRSV感染相关的细胞受体

1.5 慢病毒载体系统的概述

1.5.1 慢病毒载体系统的研究进展

1.5.2 慢病毒载体的基本结构

1.5.3 慢病毒载体包装细胞系的优点

1.6 Toll样受体

1.6.1 Toll样受体概况

1.6.2 Toll样受体在免疫学中的作用

1.7 PRRSV与炎症反应

1.7.1 炎症细胞因子

1.7.2 PRRSV诱导的炎症反应

1.8 本研究的目的及意义

2 材料和方法

2.1 细胞、毒株及载体

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器设备

2.4 PAM细胞的分离培养及总RNA的提取

2.4.1 原代猪肺泡巨噬细胞的分离培养

2.4.2 Trizol法提取猪PAM细胞的总RNA

2.5 猪CD163基因的克隆

2.5.1 猪CD163受体基因的引物设计及合成

2.5.2 PCR方法扩增猪CD163基因

2.5.3 猪CD163基因与克隆载体pEASY-T1的连接

2.5.4 连接产物的转化

2.5.5 质粒的提取与鉴定

2.6 慢病毒基因过表达载体pLV-EGFP-CD163的构建与鉴定

2.6.1 慢病毒基因过表达载体pLV-EGFP-CD163的构建

2.6.2 慢病毒基因过表达载体pLV-EGFP-CD163的鉴定

2.7 慢病毒的制备和表达CD163的稳定细胞系的建立

2.7.1 慢病毒的制备

2.7.2 最佳嘌呤霉素浓度的筛选

2.7.3 表达CD163的稳定细胞系的建立

2.8 mPAM-CD163细胞系的鉴定

2.8.1 质粒标准品的制备

2.8.2 抗体阻断试验

2.8.3 Western-blot检测mPAM-CD163细胞系中CD163的表达情况

2.8.4 共聚焦检测mPAM-CD163细胞系中CD163的表达

2.8.5 mPAM-CD163细胞系增殖PRRSV能力和稳定性的测定

2.8.6 不同毒力PRRSV感染pPAM与mPAM-CD163后细胞因子与TLR表达水平的比较

3 结果与分析

3.1 慢病毒表达载体pLV-EGFP-CD163的构建及鉴定

3.2 稳定表达猪CD163蛋白的PAM细胞系的构建及鉴定

3.2.1 mPAM-CD163细胞系的构建

3.2.2 Western blot检测mPAM-CD163细胞系中CD163表达情况

3.2.3 共聚焦检测mPAM-CD163细胞系中CD163的表达情况

3.2.4 荧光定量PCR方法的建立

3.2.5 抗体阻断试验检测mPAM-CD163细胞系中CD163对PRRSV增殖能力的影响

3.2.6 mPAM-CD163、MARC-145、pPAM细胞增殖PRRSV能力的测定和mPAM-CD163细胞系稳定性的测定

3.2.7 不同毒力PRRSV感染pPAM与mPAM-CD163后细胞因子与TLR表达水平的测定

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

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