CRISPR/Cas9介导的IFN-γ基因在山羊乳腺上皮细胞定点敲入的初步研究

摘要

乳房炎是由病原微生物感染引起的乳房炎症，给奶山羊养殖业带来的损失十分严重。尽管抗生素的疗法能够有效的遏制乳房炎的发生，但是细菌的变异、抗生素的残留已经严重危害人类和动物的安全。因此，利用生物技术生产具有乳房炎抗性的动物对于动物的生产具有重要的意义。研究表明干扰素（IFN-γ）能够调控机体的免疫系统，抑制引起乳房炎的细菌的增殖。作为一种重要的抗感染的免疫分子，IFN-γ能够显著的降低不同细菌造成的感染。作为一种简单的高效的精确的基因编辑技术，CRISPR/Cas9广泛应用于动物模型的建立和医学。因此，本研究通过CRISPR/Cas9系统建立转IFN-γ基因的奶山羊乳腺上皮细胞模型，为生产转IFN-γ的抗乳房炎奶山羊提供重要的理论基础。 取处于泌乳期的健康崂山奶山羊乳腺组织，采用消化法培养山羊乳腺上皮细胞。通过几次消化传代将混有的成纤维细胞进行分离。为了确定所得细胞的上皮特性，采用广谱角蛋白免疫荧光染色法对细胞进行鉴定。 通过试剂盒分离人外周血淋巴细胞，Trizol法提取淋巴细胞总RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA，RT-PCR扩增得到人IFN-γ基因。 针对山羊CSN2基因设计敲入位点。在OMICTOOLS下的Cas-Designe（http://www.rgenome.net/cas-designer/）上设计sgRNA，分别输入CSN2的第二外显子和第八外显子的部分序列，从中各选择3个评分较高的sgRNA，分别连入lentiCRISPR v2载体，测序验证sgRNA序列的正确性。通过分别将测序正确的质粒转染山羊成纤维细胞，T7E1酶切鉴定不同的sgRNA对山羊基因组的打靶活性，选取打靶活性较高的一对sgRNA用于后续实验。 同源重组载体是通过对质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro基础上改造成的，使用酶切连接的方法构建同源重组载体。同源臂的设计：5’同源臂为山羊CSN2信号肽上游（包括信号肽部分），963bp大小；3’同源臂为第八外显子（包含sgRNA序列，sgRNA靠近上游）的部分序列，729bp大小。为了利用山羊β-酪蛋白（CSN2）启动子来启动外源IFN-γ的表达，采用重叠延伸PCR的方法将5’同源臂和IFN-γ基因无缝连接在一起。构建好的载体进行测序验证连入片段序列的正确性。 通过与包装质粒共转293T细胞将目的载体包装成慢病毒，通过慢病毒感染的方式转染乳腺上皮细胞，经嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞，通过PCR对克隆细胞进行鉴定并设计跨越同源臂序列的鉴别引物鉴别其是否发生同源重组。 本实验的主要研究结果如下： （1）通过消化法分离培养得到了山羊乳腺上皮细胞，并鉴定了其上皮特性。 （2）成功构建了针对山羊酪蛋白位点的CRISPR/Cas9载体，经T7E1酶鉴定有打靶活性。 （3）通过PCR扩增测序得到人IFN-γCDS区基因序列，并构建了转人IFN-γ基因的打靶（供体）载体pCDH-LA-IFN-copGFP-Puro-SA，并且在山羊乳腺上皮细胞中验证了打靶载体的功能。 （4）通过改造的慢病毒载体介导，利用CRISPR/Cas9系统成功构建了转人IFN-γ基因的山羊乳腺上皮细胞系。

目录

声明

符号说明

前言

1.1 CRISPR/Cas9系统的研究进展

1.1.1 CRISPR/Cas 系统的发现

1.1.2 CRISPR/Cas9系统的机构和作用机制

1.1.3 CRISPR/Cas 9系统的应用

1.2 奶山羊乳房炎研究进展

1.2.1 乳房炎的危害

1.2.2 乳房炎的病原

1.2.3乳房炎的治疗

1.3 IFN-γ的研究进展

1.3.1 INF-γ的产生和作用机制

1.3.2 INF-γ的生物学活性

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和载体

2.1.2 主要试剂及仪器设备

2.1.3 常用试剂的配制

2.2 方法

2.2.1 乳腺上皮细胞的分离与培养

2.2.2 CRISPR/Cas9表达载体的构建

2.2.3人IFN-γ基因的扩增

2.2.4 同源重组载体的构建

2.2.5 重组质粒的慢病毒包装

2.2.6单克隆细胞的获得及鉴定

3 结果与分析

3.1 乳腺上皮细胞的分离与培养

3.2 LentiCRISPRv2-sgRNA载体的构建结果

3.2.1 LentiCRISPR v2酶切鉴定结果

3.2.2 重组质粒的测序结果

3.2.3 sgRNA活性的鉴定结果

3.3 人IFN-γ基因的扩增结果

3.4 同源重组载体的构建结果

3.4.1 同源臂的扩增结果

3.4.2 LA-IFN片段的扩增结果

3.4.3 pCDH-LA-IFN-copGFP-T2A-Puro酶切鉴定结果

3.4.4 pCDH-LA-IFN-copGFP-T2A-Puro-SA酶切鉴定结果

3.5 慢病毒包装结果

3.6 慢病毒感染结果

3.7 单克隆细胞的鉴定结果

4 讨论

4.1 CRISPR/Cas9系统存在潜在的脱靶问题

4.2 本研究中打靶基因的选择

4.3 乳腺上皮细胞的转染

5 结论

参考文献

致谢